Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Summary

El destino de una célula embrionaria individual puede ser influenciada por las moléculas hereditarias y / o por las señales de las células vecinas. Utilizando los mapas de destino de la etapa de escisión de embriones de Xenopus, blastómeras individuales pueden ser identificados por la cultura de forma aislada para evaluar las contribuciones de moléculas hereditarias frente a las interacciones célula-célula.

Abstract

Mapas de Destino, construidas a partir de linaje rastreo de todas las células de un embrión, revelan que los tejidos descienden de cada célula del embrión. Aunque los mapas destino son muy útiles para la identificación de los precursores de un órgano y para elucidar la vía de desarrollo por el que las células descendientes rellenar ese órgano en el embrión normal, no ilustran el potencial de desarrollo de una célula precursora o identificar los mecanismos por los cuales su destino está determinado. Para poner a prueba el compromiso del destino celular, se compara repertorio normal de una célula de descendientes en el embrión intacto (el mapa de destino) con los que se expresan después de una manipulación experimental. Es el destino de la célula fija (comprometido), independientemente del entorno celular, o es influenciado por factores externos facilitados por sus vecinos? Usando los mapas completos destino del embrión de Xenopus, se describe cómo identificar, aislar y única cultura precursores estadio de división, llamado blastomeres. Este enfoque permite evaluar si estas células tempranas están comprometidos con el destino que adquieren en su entorno normal en el embrión intacto, requieren interacciones con sus células vecinas, o puede ser influenciada para expresar destinos alternativos, si expuesto a otros tipos de señales.

Introduction

Xenopus laevis embriones se han utilizado ampliamente para identificar los mecanismos por los cuales las células embrionarias adquieren sus destinos específicos debido a que sus huevos son lo suficientemente grandes para permitir que los enfoques de microcirugía. Además, se desarrollan de forma externa sin la necesidad de suplementación nutricional del medio de cultivo debido a que cada célula contiene un rico suministro intracelular de las plaquetas de yema de que proporcionan una reserva de energía intrínseca. Un activo importante para el estudio de los mecanismos por los cuales se determina el destino celular es el conjunto completo de mapas de destino de los blastómeros estadio de división (de 2 – a través de las etapas de 32 células) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Estos mapas fueron construidos por microinyección de una molécula detectable en un blastómeras, identificables y seguimiento posterior en el desarrollo de los tejidos que están pobladas por los descendientes etiquetados. Mapas consistentes destino son posibles porque los ejes cardinales de los embriones pueden ser identificadas con toda fiabilidad en muchos embryos. En primer lugar, en todos los embriones de tipo salvaje del hemisferio animal es pigmentada, mientras que el hemisferio vegetal no lo es. En segundo lugar, la entrada del esperma en la fertilización produce una contracción de la pigmentación hemisferio animal hacia el lado ventral futuro; en muchos embriones una diferencia pigmentación por lo tanto se puede utilizar para discriminar entre los lados dorsal y ventral. En tercer lugar, el surco de división primera aproxima el plano sagital medio en la mayoría de los embriones, y por lo tanto se puede utilizar para identificar los lados derecho e izquierdo del embrión. Los mapas de destino también se basan en el hecho de que, naturalmente, los huevos fertilizados con frecuencia se unirá en patrones regulares que hacen que cada blastómero identificable a través de una gran población de embriones. Si bien existe variabilidad dentro y entre las puestas de huevos respecto a los patrones de pigmentación y de escisión, utilizando procedimientos de selección descritos en este documento permite que las células con destino prescritos a ser identificado con una precisión del 90% aproximadamente.

Destinos celulares pueden disuadirextraído durante la embriogénesis por varios mecanismos. Los factores intrínsecos, tales como diferencialmente heredados mRNAs citoplasmáticas o proteínas, contribuyen a varios aspectos del patrón temprano. Por ejemplo, específicos de mRNAs materna determinar qué células contribuirán a la línea germinal, se convierten en el endodermo, o contribuir al eje del cuerpo dorsal (revisado en ^7). Los factores extrínsecos proporcionados localmente por células vecinas o más alejadas de un centro embrionario de señalización, son responsables de la inducción de tipos específicos de tejidos y patrones casi todos los sistemas de órganos. Ejemplos de centros de señalización incluyen la organizador / nodo en la gástrula que induce el ectodermo neural y los patrones del mesodermo, y la zona de actividad polarizante que los patrones del eje anterior-posterior del primordio de la extremidad. Aunque los mapas destino identificar los precursores de los diferentes órganos y revelar la vía de desarrollo adoptadas por sus descendientes en el embrión normal, que no pueden distinguir entre intrínsecay influencias extrínsecas en esas células. También no revelan el potencial de desarrollo de una célula, cuyos descendientes diferenciar en el complejo entorno de señalización del embrión. Dos enfoques experimentales pueden probar si el destino de una célula está determinada por factores intrínsecos o sea posteriormente influida por factores externos: 1) el trasplante de la célula a una ubicación nueva en el embrión, o 2) la eliminación de la célula del embrión seguido por cultivo en la ausencia de señales exógenas.

Ambos enfoques experimentales han sido factible en Xenopus porque las células son suficientemente grandes para separar manualmente. Por ejemplo, numerosos estudios han eliminado las células individuales a partir de embriones (para cambiar interacciones célula-célula) o células trasplantadas a lugares nuevos en los embriones de acogida para probar los cambios de destino (revisado en ^{7, 8, 9).} Además, el segundo enfoque de la explantación pequeño número de células de diferentes regiones del embrión icultura ONT para dilucidar las interacciones inductivas de tejido en ausencia de factores exógenos es posible debido a que las células del embrión de Xenopus se llenan con un almacén intracelular de nutrientes, las plaquetas de yema. Por lo tanto, se pueden cultivar durante unos días en un medio definido sin sal suplementación nutricional o factor de crecimiento del medio de cultivo. Hemos usado este enfoque para demostrar que los blastómeros animales dorsales tienen una capacidad autónoma para producir tejidos mesodérmicos neuronales y dorsal debido a la herencia materna mRNAs ^{10, 11,} y otros mostraron que mesodermo especificación de 32-celulares blastómeros se basa tanto en la información intrínseca y extrínseca ¹² . Una ventaja de cultivar células como explantes es que el medio también se puede complementar con factores de señalización definidos para determinar que la célula-a-célula vía de comunicación podrían influir en el destino de la célula explantado ^{12, 13, 14.} Además, se puede inyectar el pr blastómeroior a la cultura con ARNm para sobre-expresar un gen, o con oligonucleótidos anti-sentido para evitar la traducción de los ARNm endógenos. Estos, ganancia y pérdida de función de análisis puede identificar moléculas que se requieren para un destino autónoma expresado. Para analizar el destino del explante, la identificación de tipos específicos de células puede llevarse a cabo por la expresión de genes estándar (por ejemplo, hibridación in situ, RT-PCR) y ensayos inmunocitoquímicos. Este protocolo proporciona un simple, pero poderoso, forma de distinguir entre los mecanismos intrínsecos y extrínsecos que regulan el funcionamiento de una célula embrionaria se desarrolla en tejidos específicos.

Protocol

1. Preparación de los medios de comunicación, Cultura Instrumentos y platos Enfocar cuatro pinzas con película abrasivo de alúmina. Haga esto bajo un microscopio de disección para controlar el tamaño de la punta. Un par de pinzas sirve como una copia de seguridad en caso de que una punta se daña durante el procedimiento. Autoclave las cuatro pinzas y almacenar en un recipiente estéril. Hacer cada 500 ml de medio de cultivo 0,1 X 1,0 X y (ya sea modificado de Marc Ringers [MMR] o salinos Modi…

Representative Results

La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión el potencial de desarrollo de la célula se basa en la disección de la blastómero correcto basado en el destino mapas 1, 2, 3, 4, 5, 6. Por lo tanto, es fundamental para elegir embriones con el patrón de pigmentación correcta en la etapa 2-células, como se ilustra en la Figura 1, que posteriormente se ajustan a los patrones de escisión regulares, como se ilustra en la Figura 2. Si se observa según los embriones a …

Discussion

Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de blastómeros individuales son: 1) identificar correctamente el blastómero de interés, 2) el mantenimiento de un cultivo estéril, saludable y 3) células de disección en la parte correcta del ciclo celular, y 4) la elaboración del manual necesario destreza para evitar daños durante la disección y transferir a la cultura también.

Para manipular blastómeras específicas, es esencial para ser capaz de identificar los ejes cardinales…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use