Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion
Summary
Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.
Abstract
Perfusion-basierte ganzen Organs Dezellularisierung hat kürzlich Interesse im Bereich des Tissue Engineering als Mittel zur ortsspezifischen extrazellulären Matrix Gerüsten erstellen, gewann unter weitgehender Erhaltung der einheimischen Architektur des Gerüsts. Bisher hat dieser Ansatz in einer Vielzahl von Organsysteme verwendet worden, einschließlich Herz, Lunge, Leber und 1-5. Vorherige Verfahren zur Dezellularisierung Gewebe ohne eine leicht zugängliche Gefäßnetz haben bei längerer Exposition von Gewebe, Lösungen von Detergentien, Säuren oder enzymatische Behandlungen als Mittel, um die zellulären und atomare Bestandteile aus dem umgebenden extrazellulären Umgebung 6-8 entfernen gestützt. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Verfahren gelenkig auf der Fähigkeit der Lösungen das Gewebe durch Diffusion eindringen. Im Gegensatz dazu Perfusion von Organen durch die natürliche Gefäßsystem wirksam reduziert den Diffusionsweg und erleichtert den Transport von decellularizatiMittel zum in das Gewebe und zellulären Komponenten aus der Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode, um vollständig decellularize eine intakte Schweine Herzen durch koronare retrograde Perfusion. Das Protokoll ergab ein voll dezellularisierte kardialen extrazellulären Matrix (ECM-c) Gerüst mit der dreidimensionalen Struktur des Herzens intakt. Unser Verfahren verwendet eine Reihe von Enzymen, Detergentien und Säuren mit hypertonischen und hypotonischen Spülungen gekoppelt in der Lyse und Entfernung von Zellen unterstützen. Das verwendete Protokoll eine Trypsin-Lösung, um Zellen von der Matrix durch Triton X-100 und Natriumdesoxycholat Lösungen gefolgt, um die Entfernung von Zellmaterial unterstützen lösen. Die beschriebene Protokoll verwendet auch Perfusion Geschwindigkeiten von mehr als 2 l / min für verlängerte Zeiträume. Die hohe Strömungsgeschwindigkeit, mit der Lösung Änderungen erlaubt den Transport von Agenten des Gewebes ohne Kontamination von Zelltrümmern und gekoppelt gewährleistet effektive Spülung des Gewebes. Das beschriebene Verfahren entfernt alle Kernmaterial von native porcinen Herzgewebe, die Schaffung eines ortsspezifischen kardialen ECM Gerüst, das für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die aktuelle Studie beschriebene Methodik für eine konsistente und effiziente Dezellularisierung eines Schweine Herzen. Das Protokoll war eine Änderung an einem zuvor veröffentlichten Bericht 1 und enthalten längerer Exposition zu fließen und erhöhtem Druck, die mehr wiederholbare Ergebnisse geliefert. Die resultierende dezellularisierten Gewebe erfüllt alle veröffentlichten Kriterien für eine erfolgreiche Dezellularisierung von Gewebe 2. Häufige Änderungen Lösung wurden durchgeführt, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Brogan Gast, Michelle Weber und Kristen Lippert anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Studie wurde durch NIH Grant R03EB009237 sowie NIH Ausbildung Grants T32EB001026-06 aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering und T32HL076124-05 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
Referencias
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