퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차
Summary
신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.
Abstract
크게 비계의 기본 구조를 유지하면서 재관류 기반 전체 오르간 decellularization은 최근, 특정 사이트 세포 외 기질 공사장 공중 발판을 만들 수있는 수단으로 조직 공학 분야에 대한 관심을 얻었습니다. 현재까지이 방식은 심장, 폐, 간 1-5을 포함한 장기 시스템의 다양한 활용되었습니다. 쉽게 접근 할 수 혈관 네트워크가없는 조직에 대한 이전 decellularization 방법은 세제, 산, 또는 주변 세포 환경 6-8에서 세포와 핵 구성 요소를 제거하는 수단으로 효소 트리트먼트 솔루션에 조직의 장시간 노출시 의존하고 있습니다. 그러나, 솔루션의 능력에 따라 이러한 방법 힌지의 효과는 확산을 통해 조직을 침투합니다. 대조적으로, 자연 혈관 시스템을 통해 기관의 재관류 효과적으로 확산 거리와 decellularizati의 촉진 수송을 감소조직에서 조직과 세포의 구성 요소에 에이전트 있습니다. 여기, 우리는 완전히 관상 동맥 재관류 역행을 통해 그대로 돼지의 심장을 decellularize하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그대로 심장의 3 차원 구조를 완벽하게 decellularized 심장 세포 외 기질 (C-ECM) 비계를 굴복. 우리의 방법은 효소, 세제, 그리고 세포의 용해 및 제거에 도움 hypertonic과 hypotonic 린스와 커플 링 산 일련의를 사용했습니다. 프로토콜은 세포 물질의 제거에 도움 튼 X-100과 나트륨 deoxycholate 솔루션 다음 행렬의 세포를 분리하는 트립신 솔루션을 사용했습니다. 설명 프로토콜은보다 큰 2 L / 오랜 시간 동안 분 재관류 속도를 사용합니다. 세포 파편의 오염없이 조직에 대리인의 교통편을 허용 및 솔루션 변경과 결합 높은 유량은 조직의 린스 효과 보장. 설명 방법은 nati의 모든 핵 물질을 제거응용 프로그램의 다양한 사용할 수있는 특정 사이트 심장 ECM 비계를 만들고, 돼지의 심장 조직이 있어요.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 연구는 돼지의 마음의 일관되고 효율적인 decellularization에 대한 방법론을 설명했다. 프로토콜은 이전에 다음 ID로 출판 보고서 1 변형 등의 반복적 인 결과를 제공 흐름에 더 이상 노출 증가 압력을, 포함되어 있습니다. 그 결과 decellularized 조직은 조직이 성공적으로 decellularization에 게시 된 기준을 모두 만났다. 자주 솔루션으로 변경되며, 변경된 사항은 조직에 세포 물질의 재…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Brogan, 손님 미셸 위버, 그리고 순영이 Lippert을 인정하고 싶습니다. 본 연구를위한 기금은 NIH 그랜트 R03EB009237뿐만 아니라 국민의 생명 이미징 및 생물 공학 연구소와 T32HL076124-05에서 NIH 교육 교부금 T32EB001026-06에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
Referencias
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
