Meting van de levensduur in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster is een krachtige modelorganisme voor het verkennen van de moleculaire basis van de levensduur regelgeving. Dit protocol gaat in op de stappen die betrokken zijn bij het genereren van een reproduceerbare, populatie-gebaseerde meting van de levensduur en mogelijke valkuilen en hoe ze te vermijden.
Abstract
Veroudering is een fenomeen dat resulteert in constante fysiologische achteruitgang in bijna alle organismen waarin het is onderzocht, wat leidt tot verminderde fysieke prestaties en risico van de ziekte vergroot. Individuele veroudering manifesteert zich op populatieniveau als een toename van de leeftijdsafhankelijke sterfte, die vaak wordt in het laboratorium gemeten door het observeren levensduur in grote cohorten van vergelijkbare leeftijd individuen. Experimenten die streven naar de mate te kwantificeren welke genetische of omgevingsfactoren manipulaties invloed levensduur in eenvoudig model organismen zijn opmerkelijk succesvol geweest voor het begrijpen van de aspecten van het ouder worden die aan de overkant van de taxa en voor inspirerende nieuwe strategieën behouden voor de uitbreiding van levensduur en het voorkomen van leeftijd-geassocieerde ziekte bij zoogdieren .
De azijn Drosophila melanogaster, is een aantrekkelijke modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van veroudering als gevolg van de relatief korte levensduur, handige veeteelt, en facile genetica.De demografische maatregelen van veroudering, zoals leeftijd-overleving en mortaliteit, zijn buitengewoon gevoelig voor zelfs kleine variaties in proefopzet en milieu en handhaving van strikte laboratorium werkwijzen voor de duur van veroudering experimenten vereist. Deze overwegingen, alsmede de noodzaak om zorgvuldige controle van de genetische achtergrond oefenen, zijn essentieel voor het genereren robuuste metingen. Inderdaad, er zijn vele opmerkelijke controverses rond gevolgtrekking uit een lange levensduur experimenten in gist, wormen, vliegen en muizen die zijn terug te voeren op het milieu of genetische artefacten 1-4. In dit protocol beschrijven we een reeks procedures die zijn geoptimaliseerd gedurende vele jaren van het meten van duurzaamheid in Drosophila met behulp van laboratorium flesjes. We beschrijven ook het gebruik van de dLife software die is ontwikkeld door ons laboratorium en is beschikbaar om te downloaden ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife versnelt de doorvoer en bevordert goede praktijken door het opnemen van een optimaal experimenteel ontwerp, het vereenvoudigen van vlieg behandeling en het verzamelen van gegevens, en het standaardiseren van data-analyse. We zullen ook ingaan op de vele mogelijke valkuilen in het ontwerp, de verzameling en interpretatie van de levensduur van gegevens, en wij bieden stappen om deze gevaren te voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde protocol beschrijft een werkwijze voor reproduceerbare metingen van volwassen levensduur in Drosophila dat kan worden aangepast voor bepaling van de genetische, farmacologische en veranderingen. Cruciale aspecten van het protocol zijn zorgvuldig regelen van de larvale ontwikkeling omgeving, het minimaliseren van volwassen stress, en het minimaliseren van vooroordeel over experimentele groepen en controles. We presenteren ook het gebruik van de dLife levensduur experiment management softwa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) en NIH R01AG030593 (SDP). Dit werk van de middelen van de Drosophila Aging Core (DAC) van de Nathan Shock Center of Excellence gebruikt in de biologie van veroudering gefinancierd door het National Institute of Aging P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). De auteurs willen graag de Pletcher Laboratorium bedanken voor nuttige discussies en vooral Brian Chung voor kritisch lezen van het manuscript. Wij willen Nick Asher en Kathryn Borowicz erkennen voor hulp bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
Referencias
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an ‘aging gene’ in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?. PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
