Misura della durata della vita in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster è un organismo modello potente per esplorare le basi molecolari della regolazione longevità. Questo protocollo discuterà i passaggi necessari per generare una riproducibile, basato sulla popolazione, la misurazione della longevità e gli eventuali rischi potenziali e come evitarli.
Abstract
L'invecchiamento è un fenomeno che si traduce in costante deterioramento fisiologico in quasi tutti gli organismi in cui è stato esaminato, con conseguente riduzione delle prestazioni fisiche e aumento del rischio di malattia. Invecchiamento individuale si manifesta a livello di popolazione, come un aumento della mortalità età-dipendente, che viene spesso misurata in laboratorio osservando la durata della vita in ampie coorti di individui di pari età. Gli esperimenti che cercano di quantificare la misura in cui le manipolazioni genetiche o ambientali impatto durata della vita in organismi modello semplici hanno riscosso un notevole successo per la comprensione degli aspetti dell'invecchiamento che si conservano in taxa e per ispirare nuove strategie per estendere la durata della vita e la prevenzione della malattia associata all'età nei mammiferi .
La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un organismo modello attraente per lo studio dei meccanismi di invecchiamento a causa della sua relativamente breve vita, allevamento conveniente, e la genetica facili.Tuttavia, le misure demografiche di invecchiamento, tra cui l'età-specifica e la mortalità, sono straordinariamente sensibili a variazioni anche minime nel disegno sperimentale e l'ambiente, e il mantenimento di pratiche di laboratorio rigorose per tutta la durata degli esperimenti di invecchiamento è richiesto. Queste considerazioni, insieme con la necessità di praticare un attento controllo dei background genetico, sono essenziali per la generazione di misure robuste. In effetti, ci sono molte controversie notevoli circondano inferenza da esperimenti longevità in lievito, vermi, mosche e topi che sono stati tracciati di artefatti ambientali o genetici 1-4. In questo protocollo, si descrive una serie di procedure che sono stati ottimizzati per molti anni per misurare la longevità in Drosophila con fiale di laboratorio. Abbiamo anche descrivere l'uso del software dLife, che è stato sviluppato dal nostro laboratorio ed è disponibile per il download ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife accelera la produttività e promuovere le buone pratiche, integrando design ottimale sperimentale, semplificare la gestione e la raccolta dei dati mosca, e la standardizzazione delle analisi dei dati. Discuteremo anche le numerose insidie potenziali nella progettazione, raccolta e interpretazione dei dati di durata della vita, e mettiamo a disposizione misure per evitare questi pericoli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per produrre misurazioni riproducibili di longevità adulto in Drosophila che è adattabile per la valutazione di interventi farmacologici, genetici e ambientali. Aspetti cruciali del protocollo includono controllando attentamente l'ambiente di sviluppo larvale, riducendo al minimo lo stress degli adulti, e riducendo al minimo polarizzazione tra gruppi sperimentali e di controllo. Presentiamo anche l'utilizzo del software di gestione dell'esperimento d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Ellison Medical (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) e NIH R01AG030593 (SDP). Questo lavoro ha utilizzato le risorse del Aging Drosophila Core (DAC) del Centro di Eccellenza Nathan Shock nella biologia dell'invecchiamento finanziato dal National Institute of Aging P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Gli autori desiderano ringraziare il Laboratorio Pletcher per le discussioni utili e, in particolare Brian Chung per la lettura critica del manoscritto. Si desidera ringraziare Nick Asher e Kathryn Borowicz per l'assistenza con la raccolta dei dati.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
Referencias
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an ‘aging gene’ in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?. PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
