L'analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal
Summary
Nous avons utilisé des échantillons de la rétine rétinectomie pour une analyse transcriptomique de décollement de la rétine. Nous avons développé une procédure qui permet la conservation d'ARN entre les blocs opératoires et les laboratoires. Nous avons standardisé un protocole pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse des microréseaux.
Abstract
Décollement de la rétine (RD) décrit une séparation de la rétine neurosensorielle de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L'EPR est essentiel pour la fonction normale des neurones sensibles à la lumière, les photorécepteurs. Détachement de la rétine de l'EPR crée un espace physique qui est rempli de fluide extracellulaire. RD initie événements indésirables cellulaires et moléculaires qui affectent à la fois la rétine neurosensorielle et l'EPR depuis l'échange physiologique des ions et des métabolites est gravement perturbé. La conséquence de vision est liée à la durée du détachement depuis un réapposition rapide des deux tissus entraîne la restauration de la vision 1. Le traitement de la RD est exclusivement chirurgical. L'élimination du corps vitré (vitrectomie) est suivie de l'enlèvement partie non essentielle de la rétine autour de la zone individuelle de favoriser un décollement de rétine. Les spécimens rétiniennes enlevées sont res nullius (rien) et, normalement, par conséquent rejetées.Pour récupérer l'ARN à partir de ces prélèvements chirurgicaux, nous avons développé la procédure Journal qui permet la conservation d'ARN pendant le transfert du bloc opératoire au laboratoire. Nous avons également un protocole standardisé pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse de l'expression génique globale. La qualité de l'ARN a été validé à la fois par RT-PCR et l'analyse des microréseaux. L'analyse des données montre une implication simultanée de l'inflammation et la dégénérescence des photorécepteurs au cours de RD.
Introduction
L'objectif thérapeutique principal de décollement de la rétine (RD) est de trouver un moyen de limiter les dommages aux cellules des photorécepteurs et inflammation de la rétine résultant de la séparation des photorécepteurs à partir des cellules épithéliales pigmentées de la rétine. Au cours de RD, les cellules RPE sont activés, migrer, dédifférencier et prolifèrent à la surface de la rétine décollée, exerçant des forces contractiles conduisant à des complications. Analyse transcriptomique de la RD est un moyen d'identifier les gènes cibles avec une expression modifiée suite RD et donc futures molécules thérapeutiques qui pourraient améliorer le résultat visuel final association avec la chirurgie. Il est bien connu d'acide ribonucléique (ARN) n'est pas stable comme l'acide désoxyribonucléique (ADN), ce dernier étant largement utilisé pour des études génétiques, sa stabilité avait permis le séquençage du génome de Neandertal à partir d'échantillons paléontologiques de plus de 30.000 ans 2. Transcription de l'ADN des gènes du génome en ARN messager est l'processus important dans l'expression du gène, et l'ARNm est labile en vue de constituer un signal. ARN sont très rapidement dégradés par les enzymes RNAse qui se terminent le signal. Lorsque les tissus sont isolés d'un organisme, les ARN sont très souvent dégradés avant l'expression est étudiée dans un laboratoire de recherche. ARN dégradé n'est pas adapté pour l'expression du gène de l'analyse. Parce que le personnel du laboratoire ne peut pas participer à la chirurgie, nous avons développé une procédure qui est simple et ne requiert que le chirurgien de récupérer les tissus dans une solution RNAse approprié. Les ARN des tissus est stable et peuvent être analysées sans aucun signe de dégradation après 72 heures à la température ambiante dans cette solution. Les ARN à partir d'échantillons sont purifiés par une méthode standardisée comportant une ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium, après avoir été transféré au laboratoire 3. Ensuite, la qualité des ARN est évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose et par RT-PCR. Le protocole de purification d'ARN a leavantage de séparer les molécules en fonction de leur densité qui est différente de l'ADN et de l'ARN et qui donne à l'ARN n'est pas contaminé par une molécule d'ADN qui vont générer des signaux d'artefact dans des études d'expression génique. En outre, les ARN de transfert (ARNt), qui sont quantitativement ARN les plus abondants dans une cellule, sont séparés selon la même propriété physique de l'ARN ribosomal (ARNr) et les ARN messagers (ARNm), ces deux derniers étant l' produit final du procédé de purification. La suppression de l'ARNt de la préparation est utile car la plupart des protocoles d'analyse microarray impliqué l'utilisation de transcriptases inverses et ARN polymérases qui sont inhibées par l'ARNt 4-6. L'ARN purifié à partir de prélèvements chirurgicaux sont étiquetés en utilisant le protocole standard et hybridées à une biopuce et les résultats sont analysés par deux méthodes complémentaires, la méthode du taux de fausses découvertes, et en utilisant une nouvelle méthode basée sur l'information mutuelle et visualisation enzed sur le serveur Web Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'élaboration d'une procédure de recouvrement de tissu du bloc opératoire a été essentielle à l'analyse du transcriptome de décollement de la rétine. Il faut remarquer que ce type de chirurgie est pratiquée en urgence et que les ophtalmologistes exploitation ont peu de temps pour participer à un programme de recherche biologique quand ils opèrent. Cette rétinectomie est également effectuée stochastique dans chaque service, de sorte que le plus simple pour atteindre le nombre statistiques est de…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Sacha Reichman et Dominique Santiard-Baron pour leur aide dans l'édition du protocole de purification d'ARN.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referencias
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