Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale
Summary
Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un'analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi di microarray.
Abstract
Distacco di retina (RD) descrive una separazione della retina neurosensoriale dalla epitelio pigmentato retinico (RPE). La RPE è essenziale per la normale funzione dei neuroni sensibili alla luce, i fotorecettori. Distacco della retina dal RPE crea un gap fisico che è pieno di fluido extracellulare. RD avvia eventi avversi cellulari e molecolari che influenzano sia la retina neurosensoriale e la RPE in quanto lo scambio fisiologico di ioni e metaboliti è gravemente perturbato. La conseguenza per la visione è legata alla durata del distacco poiché una rapida reapposition dei due tessuti determina il ripristino della visione 1. Il trattamento della RD è esclusivamente chirurgica. Rimozione del gel vitreale (vitrectomia) è seguita dalla rimozione non parte essenziale della retina intorno alla zona distaccata per favorire il distacco di retina. Gli esemplari della retina rimosse sono res nullius (nulla) e di conseguenza normalmente scartati.Per recuperare RNA da questi campioni chirurgici, abbiamo sviluppato la procedura ufficiale che permette di RNA conservazione durante il trasferimento dal blocco chirurgico al laboratorio. Abbiamo anche un protocollo standardizzato per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi globale dell'espressione genica. La qualità del RNA è stato convalidato sia mediante RT-PCR e microarray. L'analisi dei dati mostra un coinvolgimento simultaneo di infiammazione e la degenerazione dei fotorecettori durante RD.
Introduction
Il principale obiettivo terapeutico nel distacco di retina (RD) è di trovare un modo per limitare i danni fotorecettori retinici e infiammazione risultante dalla separazione dei fotorecettori dalle cellule epiteliali pigmentate retiniche. Durante RD, vengono attivati cellule RPE, migrare, dedifferentiate, e proliferano sulla superficie della retina distaccata, esercitando forze contrattili conducono a complicazioni. Analisi trascrittomica di RD è un modo per identificare i geni bersaglio con l'espressione modificata a seguito di RD e quindi futuri molecole terapeutiche che potrebbero migliorare il risultato visivo finale in combinazione con la chirurgia. E 'ben noto l'acido ribonucleico (RNA) non è stabile come è acido desossiribonucleico (DNA), quest'ultimo essendo ampiamente utilizzato per studi genetici, la sua stabilità aveva permesso il sequenziamento del genoma Neanderthal da campioni paleontologici di più di 30.000 anni 2. Trascrizione del DNA dei geni dal genoma in RNA messaggero è l'processo importante nell'espressione genica, e l'mRNA è labile per costituire un segnale. RNA sono molto rapidamente degradato dalla RNAsi enzimi che terminano il segnale. Quando i tessuti sono isolati da un organismo, gli RNA sono molto spesso degradate prima che l'espressione è studiata in un laboratorio di ricerca. RNA degradato non è adatto per l'analisi di espressione genica. Perché il personale di laboratorio non può partecipare in chirurgia, abbiamo sviluppato una procedura che è facile e richiede solo che il chirurgo di recuperare i tessuti in un'appropriata soluzione RNase-free. L'RNA dei tessuti è stabile e può essere analizzate senza segni di degradazione dopo 72 ore a temperatura ambiente in questa soluzione. Gli RNA da campioni vengono purificati mediante un metodo standardizzato che coinvolge un ultracentrifugazione su un gradiente di cloruro di cesio dopo essere stato trasferito al laboratorio 3. Poi, la qualità degli RNA sono valutati mediante elettroforesi su gel di agarosio e mediante RT-PCR. Il protocollo di purificazione dell'RNA ha l'vantaggio di separare le molecole secondo la loro densità che è diversa per DNA e RNA e assicura che l'RNA non viene contaminato da una molecole di DNA che generano segnali artefatti in studi di espressione genica. Inoltre, gli RNA di trasferimento (tRNA), che sono quantitativamente le RNA più abbondanti all'interno di una cellula, siano separate per la stessa proprietà fisico dal RNA ribosomiale (rRNA) e gli RNA messaggero (mRNA), quei due ultimo la prodotto finale del processo di depurazione. La rimozione del tRNA dalla preparazione è utile in quanto la maggior parte dei protocolli di analisi di microarray coinvolto l'uso di trascrittasi inversa e la RNA polimerasi, che sono inibiti da tRNA 4-6. L'RNA purificato da campioni chirurgici sono etichettati utilizzando il protocollo standard e ibridati un chip microarray ed i risultati vengono analizzati utilizzando due metodi complementari, il metodo tasso scoperta falsi, e utilizzando un nuovo metodo basato su informazioni reciproca e visualizzed sul server web-based Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo di una procedura di recupero tessuto dal blocco chirurgico è stato essenziale per l'analisi del trascrittoma di distacco di retina. Si dovrebbe notare che questo tipo di intervento viene praticato in emergenza e che il oculisti operativo hanno poco tempo per partecipare a un programma di ricerca biologica in cui esse operano. Questo retinectomy viene anche eseguito stocasticamente in ogni servizio, in modo che il modo più facile raggiungere numeri statistici è di lavorare con una rete. In tale rete, l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sacha Reichman e Dominique Santiard-Baron per il loro aiuto nel modificare il protocollo di purificazione dell'RNA.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referencias
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