Análise de Transcriptoma Humanos espécimes cirúrgicos retina utilizando Jornal
Summary
Usamos amostras de retina de retinectomy para uma análise transcriptomic de descolamento de retina. Foi desenvolvido um processo que permite a conservação de ARN entre os blocos cirúrgicos e laboratoriais. Temos um protocolo padronizado para purificar RNA por ultracentrifugação de cloreto de césio para assegurar que os ARN purificados são adequados para a análise de microarray.
Abstract
Descolamento da retina (RD) descreve a separação da retina neurosensorial do epitélio pigmentado da retina (RPE). O RPE é essencial para a função normal dos neurônios sensíveis à luz, os fotorreceptores. Descolamento de retina, a partir do RPE cria uma lacuna física que é preenchido com o fluido extracelular. RD inicia os eventos adversos celulares e moleculares que afectam tanto a retina neurosensorial e o RPE desde a troca fisiológico de iões e metabolitos é gravemente perturbada. A consequência de visão está relacionada com a duração do desprendimento desde um reapposition rápida dos dois tecidos resulta na restauração da visão 1. O tratamento de RD é exclusivamente cirúrgico. A remoção do gel vítreo (vitrectomia) é seguido pela remoção de parte não essencial da retina em torno da área individual para favorecer descolamento da retina. As amostras retiradas da retina são res nullius (nada) e, conseqüentemente, normalmente descartado.Para recuperar RNA desses espécimes cirúrgicos, desenvolvemos o processo diário que permite a conservação da RNA durante a transferência do bloco cirúrgico para o laboratório. Também um protocolo padronizado para purificar RNA por ultracentrifugação de cloreto de césio para assegurar que os ARN purificados são adequados para análise da expressão genética global. A qualidade do RNA foi validada tanto por RT-PCR e análise de microarray. A análise dos dados mostra uma participação simultânea da inflamação e degeneração de fotorreceptores durante RD.
Introduction
O principal objectivo terapêutico no descolamento da retina (DR) é a de encontrar uma maneira para limitar os danos de células fotorreceptoras da retina e inflamação resultante da separação dos fotorreceptores a partir das células epiteliais pigmentadas da retina. Durante RD, células de RPE são activados, migrar desdiferenciem, e proliferar na superfície da retina descolada, exercendo forças contrácteis levando a complicações. Análise transcriptômica de RD é uma maneira de identificar genes-alvo com expressão alterada na sequência RD e, portanto, futuros moléculas terapêuticas que poderiam melhorar o resultado visual final em combinação com a cirurgia. É bem sabido que o ácido ribonucleico (RNA) não é estável como é o ácido desoxirribonucleico (ADN), o último sendo amplamente utilizados para estudos genéticos, a sua estabilidade tinha permitido a sequenciação do genoma a partir de amostras neandertalense paleontológicos de mais de 30.000 anos de idade 2. A transcrição do DNA dos genes a partir do genoma em RNA mensageiro é oimportante no processo de expressão de genes, e o mRNA é instável, a fim de constituir um sinal. RNAs são muito rapidamente degradados pelas enzimas ARNase que terminam o sinal. Quando são isoladas a partir de tecidos de um organismo, os RNAs são muitas vezes degradados antes que a expressão é estudado num laboratório de investigação. RNA degradado não é adequado para análise de expressão génica. Porque o pessoal do laboratório não pode participar de cirurgia, foi desenvolvido um procedimento que é fácil e requer apenas que o cirurgião para recuperar os tecidos em uma solução de RNase apropriado. O ARN dos tecidos é estável e pode ser analisado sem qualquer sinal de desgaste, após 72 horas à temperatura ambiente nesta solução. Os ARN provenientes de amostras são purificados por um método normalizado que envolve uma ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio depois de ter sido transferido para o laboratório 3. Em seguida, a qualidade dos ARN são avaliados por electroforese em gel de agarose e por RT-PCR. O protocolo de purificação de RNA tem ovantagem de separar as moléculas de acordo com a sua densidade, que é diferente do DNA e RNA e assegura que o ARN não é contaminada por uma moléculas de ADN que irão gerar sinais artefatuais em estudos de expressão de genes. Além disso, os ARN de transferência (ARNt), que são quantitativamente o ARN mais abundantes no interior de uma célula, são separados de acordo com as mesmas propriedades físicas do RNA ribossomal (rRNAs) e o RNA mensageiro (mRNA), os dois últimos sendo um deles o o produto final do processo de purificação. A remoção de ARNt a partir da preparação é útil uma vez que a maioria dos protocolos analíticos microarray envolveu a utilização de transcriptase reversa e ARN polimerases que são inibidos pelo ARNt 4-6. O ARN purificado a partir de amostras cirúrgicas são rotulados usando o protocolo padrão e hibridado com um chip de microarray, e os resultados são analisados utilizando dois métodos complementares, o método de taxa de detecção falsa, e utilizando um novo método baseado na informação mútua e visualized no servidor web-based Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento de um processo para a recuperação do tecido a partir do bloco cirúrgico tem sido essencial para a análise do transcriptoma de descolamento da retina. Deve-se notar que este tipo de cirurgia é praticada em situações de emergência e que o oftalmologista operacional têm pouco tempo para participar de um programa de pesquisa biológica quando operam. Este é também realizada retinectomy estocasticamente em cada serviço, de modo que a maneira mais fácil de atingir números estatísticos é traba…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Sacha Reichman e Dominique Santiard-Baron pela ajuda na edição do protocolo de purificação RNA.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referencias
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Bioquímica. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
