Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade
Summary
Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.
Abstract
Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei en de hergroei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Inderdaad, is de primaire olfactorische systeem gekenmerkt door het vermogen om aanleiding te geven tot nieuwe neuronen zelfs bij volwassen dieren. Deze bijzondere vermogen is deels te wijten aan de aanwezigheid van OECS die een gunstig micro-omgeving te creëren voor de neurogenese. Deze eigenschap van OECS is gebruikt voor cellulaire transplantatie zoals bij ruggenmergletsel modellen. Hoewel het perifere zenuwstelsel heeft een grotere capaciteit om te regenereren na zenuwschade dan het centrale zenuwstelsel, compleet secties induceren misrouting tijdens axonale hergroei in het bijzonder na het gezicht van laryngeus doorsnijding. Specifiek, volledige opdeling van de recurrens (RMN) induceert afwijkende axonale hergroei resulteert in synkinesis van de stembanden. In dit specifieke model, hebben we aangetoond dat OECS transplantatie efficiënt verhoogt axonale hergroei.
ve_content "> OECS worden gevormd van verschillende subpopulaties aanwezig in zowel de olfactorische mucosa (OM-OECS) en reukbollen (OB-OECS). We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van deze verschillende subpopulaties OECS in een RLN letsel model. Met behulp van dit paradigma, primaire culturen van OB-OECS en OM-OECS werden getransplanteerd in Matrigel na sectie en anastomose van de RLN. Twee maanden na de operatie, we door aanvullende analyses geëvalueerd getransplanteerde dieren op basis van videolaryngoscopy, elektromyografie (EMG) en histologische studies. eerste videolaryngoscopy konden we larynx functies uitwerken, met name spier cocontractions verschijnselen. Vervolgens EMG analyses toonden rijkdom en synchronisatie van spieren activiteiten. Tenslotte histologische studies gebaseerd op toluidine blauw kleuring kon de kwantificering van het aantal en profiel gemyeliniseerde vezels.Alles bij elkaar, beschrijven we hier hoe te isoleren, cultuur, identify en transplantatie OECS van OM en OB na RLN sectie-anastomose en hoe te evalueren en analyseren van de efficiëntie van deze getransplanteerde cellen op axonale hergroei en laryngeale functies.
Introduction
Het primaire olfactorische systeem bestaat uit twee afzonderlijke delen, de olfactorische mucosa (OM) in perifere zenuwstelsel en de bulbus olfactorius (OB) in het centrale zenuwstelsel. Het primaire olfactorische systeem wordt gekenmerkt door het vermogen van de primaire olfactorische neuronen (PON) om te hernieuwen hele leven zoogdiersoorten. Dit vermogen wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van neurale stamcellen in de OM. PON groei en hergroei van OM tot OB wordt gefaciliteerd door gespecialiseerde gliacellen genoemd olfactorische ensheathing cellen (OECS). OECS zijn neurale lijst cellen die een gunstig micro-omgeving te creëren voor neurogenese van de PON van OM tot OB 1. Daardoor kan OECS worden gevonden in OM en in OB vormen verschillende subpopulaties van cellen 2,3. De verschillende eigenschappen van OECS hebben geleid wetenschappers om ze te gebruiken voor cellulaire transplantaties in verschillende zenuwstelsel laesie paradigma 4. Inderdaad, OECS produceren groeifactoren, verminderen gliale littekens, promote axonale hergroei, en kan vrij vermengen met astrocyten 5,6. De overgrote meerderheid van deze studies zijn gebaseerd op ruggenmergletsel (SCI), weinige daarvan OECS gebruikt na perifere zenuwschade (PNI) 7,8.
Hoewel het perifere zenuwstelsel heeft een grote capaciteit om te regenereren na zenuwletsel, compleet secties induceren afwijkende axonale hergroei. Inderdaad, na volledige doorsnijdingen van het gezicht of de terugkerende larynx zenuwen (RMN) ze verkeerd verzonden axonen veroorzaken gespierde cocontractions genoemd synkinesis. Daarom is het van primair belang om een model van PNI voorstellen om niet alleen kwantificeren axonale hergroei maar ook de efficiëntie van de spiersamentrekkingen evalueren. In de literatuur het meest voorkomende model wordt beschreven, is gebaseerd op het gezicht zenuwlaesie 9,10. In dit model worden functionele evaluaties op basis van het herstel van de snorhaar bewegingen 10. Het is echter ingewikkeld om de efficiëntie van de mov tonenements en de gespierde cocontractions verschijnselen discrimineren. We stellen hier een model gebaseerd op een RLN laesie. Dit model maakt de evaluatie van niet alleen axonale hergroei en bewegingen van de stembanden maar ook de efficiëntie en functionaliteit van deze bewegingen na cellulaire transplantaties 11,12. Dit protocol voorziet in een stapsgewijze procedure om de cultuur en de transplantatie OECS van OM en OB in een RLN sectie / anastomose model en dieren te evalueren na de operatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde technieken maken OECS een bruikbaar model om cellulaire transplantaties studeren in perifere zenuwschade modellen. De celkweek protocol is relatief eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd. Aan de andere kant, chirurgische ingrepen, met name punt / anastomose van de RLN, vereist ervaring en moeten door gekwalificeerd personeel worden uitgevoerd.
De in dit protocol beschreven procedures markeer belangrijke factoren te richten op om de best mogelijke resultaten te …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants respiratoires) en Fondation de l'Avenir erkennen voor hun financiële steun en Dr Fanie Barnabe-Heider voor het bewerken van het manuscript.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
Referencias
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
