El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico
Summary
Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.
Abstract
Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento y la regeneración de las neuronas olfatorias primarias. De hecho, el sistema olfativo principal se caracteriza por su capacidad para dar lugar a nuevas neuronas, incluso en los animales adultos. Esta habilidad particular, se debe en parte a la presencia de la OECO que crean un microambiente favorable para la neurogénesis. Esta propiedad de OECs se ha utilizado para el trasplante celular, tales como en modelos de lesión de la médula espinal. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una mayor capacidad de regenerarse después de una lesión del nervio que el sistema nervioso central, secciones completas inducir encaminamiento erróneo durante el rebrote axonal en particular, después de la cara de la transección del nervio laríngeo. Específicamente, llena la sección del nervio laríngeo recurrente (NLR) induce el rebrote axonal aberrante que resulta en synkinesis de las cuerdas vocales. En este modelo específico, se demostró que el trasplante OECs aumenta eficazmente el recrecimiento axonal.
ve_content "> OECs están constituidos de varias subpoblaciones presentes tanto en la mucosa olfativa (OM-OECO) y los bulbos olfativos (Ob-OECO). Presentamos aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de estas diferentes subpoblaciones de OECs en un modelo de lesión del NLR. Utilizando este paradigma, los cultivos primarios de OB-OECs y OM-OECs se trasplantaron en matrigel después de la sección y anastomosis del NLR. Dos meses después de la cirugía, se evaluaron animales trasplantados por análisis complementarios sobre la base de videolarin-goscopia, la electromiografía (EMG) , y los estudios histológicos. Primero, videolarin-goscopia nos permitió evaluar las funciones de la laringe, en particular cocontractions musculares fenómenos. Entonces, EMG analiza riqueza demostrada y sincronización de las actividades musculares. Finalmente, los estudios histológicos basado en azul de toluidina tinción permite la cuantificación del número y perfil de fibras mielinizadas.Todos juntos, como se describe aquí cómo aislar, cultura, identify y trasplante OECs de OM y OB después NLR sección anastomosis y la forma de evaluar y analizar la eficacia de estas células trasplantadas en las funciones de rebrote y laríngeos axonal.
Introduction
El sistema olfativo principal se compone de dos partes distintas; la mucosa olfativa (OM) en el sistema nervioso periférico y el bulbo olfatorio (OB) en el sistema nervioso central. El sistema olfativo principal se caracteriza por la capacidad de las neuronas olfativas primarios (PON) de auto-renovación durante toda la vida en las especies de mamíferos. Esta capacidad se hace posible debido a la presencia de células madre neurales en la OM. PON crecimiento y la regeneración de la OM de OB se ve facilitada por las células gliales especializadas llamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs son las células de la cresta neural, que crean un microambiente favorable para la neurogénesis del PON de OM a OB 1. De este modo, OECs se puede encontrar en OM y en el OB constituyendo diferentes subpoblaciones de células 2,3. Las diferentes propiedades de la OECO han principales científicos de utilizarlos para trasplantes celulares en varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso 4. De hecho, los factores de crecimiento de productos OECs, reducen la cicatrización glial, prregeneración axonal Omote, y puede mezclarse libremente con astrocitos 5,6. Sin embargo, la gran mayoría de estos estudios se basan en la lesión de la médula espinal (SCI); pocos de ellos han utilizado OECs después de la lesión del nervio periférico (PNI) 7,8.
Aunque el sistema nervioso periférico tiene una gran capacidad de regenerarse después de una lesión nerviosa, secciones completas inducir la regeneración axonal aberrante. De hecho, después de transección completa de la cara o de los nervios laríngeos recurrentes (NLR) de los axones mal enrutadas causan cocontractions musculares llamados synkinesis. Por lo tanto, es de importancia primaria a proponer un modelo de PNI no sólo para cuantificar la regeneración axonal, pero también para evaluar la eficacia de las contracciones musculares. En la literatura el modelo más común descrito se basa en 9,10 lesión del nervio facial. En este modelo, las evaluaciones funcionales se basan en la recuperación de los movimientos de la barba 10. Sin embargo, es complicado de demostrar la eficiencia de la movmentos y discriminar los cocontractions fenómenos musculares. Proponemos aquí un modelo basado en una lesión del NLR. Este modelo permite la evaluación no sólo de regeneración axonal y los movimientos de las cuerdas vocales, sino también la eficiencia y la funcionalidad de estos movimientos después de los trasplantes celulares 11,12. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso a la cultura y el trasplante OECs de OM y OB en un modelo de la sección del NLR / anastomosis y evaluar los animales después de la cirugía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas presentadas aquí hacen OECs un modelo útil para estudiar los trasplantes celulares en modelos de lesión del nervio periférico. El protocolo de cultivo de células es relativamente sencillo y se puede llevar a cabo fácilmente. Por otro lado, los procedimientos quirúrgicos, en particular la sección / anastomosis del NLR, requieren experiencia y deben ser realizadas por personal cualificado.
Los procedimientos descritos en este protocolo destacan factores importantes para c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer ADIR (Aide à domicile aux Insuffisants respiratoires) y Fondation de l'Avenir, por su apoyo financiero y el Dr. Fanie Barnabé-Heider para la edición del manuscrito.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
Referencias
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