Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell
Summary
Dubbele camera emissie splitsen systemen voor twee-kleuren fluorescentie microscopie genereren real-time beeld sequenties met een uitzonderlijke optische en temporele resolutie, een eis van bepaalde levende cel proeven, waaronder parallelle plaat stroom kamer adhesietesten. Wanneer de software wordt gebruikt om beelden van simultane emissie kanalen samenvoegt, worden pseudocolored beeldsequenties geproduceerd.
Abstract
Multi-color immunofluorescentie microscopie specifieke moleculen te detecteren in de celmembraan kan worden gekoppeld met parallelle plaat stroming kamer assays mechanismen die celhechting onder dynamische stroomomstandigheden te onderzoeken. Zo kunnen kankercellen waarop meerdere fluoroforen worden doorbloed over een mogelijk reactieve substraat mechanismen van kanker metastase model. Echter, multi-kanaals enkele camerasystemen en kleurencamera's tekortkomingen vertonen in beeldopname voor real-time live cell analyse. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we gebruik gemaakt van een dubbele camera uitstoot splitsing systemen tegelijkertijd vangen real-time beeld sequenties van fluorescent gelabelde cellen in de stroom kamer. Dubbele camera emissie splitsen systemen filter gedefinieerde golflengte varieert in twee monochrome CCD-camera's, waardoor gelijktijdig vastleggen van twee ruimtelijk identiek, maar fluorophore-specifieke beelden. Vervolgens worden psuedocolored eenkanaals beelden gecombineerd in eenreal-time fusie sequentie die meerdere doelmoleculen kunnen onthullen op cellen snel bewegen over een van belang.
Introduction
Werkwijzen voor de analyse van moleculen op het celoppervlak, zoals immunokleuring, gebruiken probes die chemisch geconjugeerd aan fluoroforen, waardoor detectie van doelmoleculen. Live cell imaging en hydrodynamische flow-based cel adhesie testen worden meestal opgenomen met monochrome CCD-camera's ontworpen om fysiologische processen vast te leggen op de cellulaire en / of moleculair niveau 1, 2. Deze camera's zijn zeer gevoelig, leveren snel frame rates (meer dan 30 frames per seconde), en bieden buitengewone temporele resolutie (als gevolg van een hoge beeldsnelheid en korte belichtingstijden). Echter, monochrome camera's slechts een enkele emissie kanaal (het detecteren van een enkele fluorofoor) om beelden te verzamelen vastleggen. Een camera emissie splitsen systemen kunnen worden opgenomen om meerdere kanalen emissie vangen maar vaak verminderen het gezichtsveld en vereisen dezelfde belichtingstijd voor beeldvorming alle kanalen. Om het volledige kleurenspectrum van cellen gelabeld met multip vastleggenle fluoroforen, een kleurencamera worden gebruikt als alternatief. Echter, kleurencamera's in het algemeen niet in staat om het gewenste temporele resolutie voor beeldvorming van levende cellen in bepaalde toepassingen. Een andere afbeeldingsinrichting is nodig voor toepassingen waarbij het de voorkeur beeld levende cellen bij verschillende golflengten met behoud van een hoge tijdsresolutie. Een van de belangrijkste experimentele toepassing is de parallelle plaat stroom kamer adhesieanalyse, waarbij cellen worden doorbloed bij fysiologisch relevante omstandigheden over een mogelijk reactieve substraat 1, 3. Cellen in flow die specifieke celoppervlak-moleculen tot expressie kunnen hechten en rollen op het substraat, zoals een cel monolaag expressie adhesiemoleculen of-oppervlak geadsorbeerd extracellulaire matrixeiwitten 4, 5. Rolling cellen kunnen rotatie en translatie ondergaan in een fractie van een seconde. Moleculaire functies op rollen en hechtende cellen, zoals clusters van celoppervlak moleculen, ook de potentiometeral actief reorganiseren op het celoppervlak. Zo moet beeldvormingssystemen uitzonderlijk temporele resolutie bieden (30 frames per seconde of meer en "bijna nul" blootstellingstijden) aan een sequentie van beelden die de stap-voor-stap progressie van cellen rollen 6, 7 illustreert genereren. Dubbele camera emissie splitsing systemen zijn in staat om aan deze eisen voor de beeldvorming van cellen gelabeld met meerdere fluoroforen.
Dual camera emissie splitsen systemen splitsen en filter fluorescentie kanalen in twee soortgelijke camera's tegelijk vastleggen twee ruimtelijk identieke maar fluorofoor-specifieke beelden met behoud van de volledige gezichtsveld. Deze technologie maakt een directe vergelijking van de opname in real-time in elk kanaal en kan de gebruiker snel schakelen tussen camera modellen met verschillende imaging-mogelijkheden. Deze functie is handig voor het maken van aanpassingen aan het vastleggen van instellingen in een camera die beter kan het systeem om vast te leggenfluoroforen met verschillende intensiteiten, levens, en extinctiecoëfficiënten 8. In combinatie met imaging software, dubbele camera emissie splitsen systemen maken het real-time opname van live cell imaging assays in meerdere golflengten en kan in vitro testen die fluorescentie gebruikt om mobiele gedrag te bestuderen verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De dubbele camera emissie splitsysteem heeft de ruimte, tijd, en optische resolutie die nodig is om hoge kwaliteit beelden vast te leggen in toepassingen waar cel of moleculaire beweging is snel. Bij het genereren van de representatieve resultaten, parameters in de dubbele camera emissie splitsysteem, waaronder software-instellingen en camera-instellingen, werden geoptimaliseerd om een samengevoegde afbeelding volgorde waarin rollen en hechtende cellen waren ruimte en tijd uitgelijnd verkrijgen. Deze optimalisatie…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Douglas Goetz (afdeling Chemische en Biomoleculaire Engineering, Ohio University) en dr. Fabian Benencia (Departement Biomedische Wetenschappen, Universiteit van Ohio) bedanken voor inzichtelijke discussies en manuscript beoordeling. We danken ook Dr Christopher Huppenbauer voor nuttige technische discussies (W. Nuhsbaum Inc). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (CBET-1106118) en de National Institutes of Health (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
Referencias
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?. Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
