Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular
Summary
Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.
Abstract
A microscopia de imunofluorescência multi-color para detectar moléculas específicas na membrana da célula pode ser acoplado com os ensaios de câmara de fluxo paralelo à placa de investigar os mecanismos que regulam a adesão de células em condições de escoamento dinâmico. Por exemplo, as células cancerosas marcadas com vários fluoróforos podem ser perfundidos sobre um substrato potencialmente reativo para modelar mecanismos de metástase do câncer. No entanto, multi-canal de sistemas únicos de câmera e câmeras coloridas deficiências apresentam na aquisição de imagens para análise de células vivas em tempo real. Para superar essas limitações, foi utilizado um sistema de separação de emissão de câmara dupla de capturar simultaneamente sequências de imagens em tempo real de células marcadas com fluorescência na câmara de fluxo. Comprimento de onda do filtro sistemas de divisão de emissão dupla de câmera definido varia em duas câmeras CCD monocromático, capturando, assim, simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicas do fluoróforo. Subsequentemente, psuedocolored imagens de um canal são combinados numa únicaem tempo real fundiu seqüência que pode revelar várias moléculas-alvo em células movendo-se rapidamente através de uma região de interesse.
Introduction
Os métodos para análise de moléculas na superfície das células, tais como a imunocoloração, empregam sondas que são quimicamente conjugados com fluoróforos, permitindo a detecção de moléculas alvo. Imagens de células vivas e ensaios de adesão de células baseadas no fluxo hidrodinâmicas são gravadas com câmeras CCD monocromático projetado para capturar os processos fisiológicos a nível celular e / ou molecular 1, 2. Essas câmeras são altamente sensíveis, entregar taxas de quadro rápidas (mais de 30 quadros por segundo), e fornecer resolução temporal excepcional (devido a taxas de quadro rápidas e tempos de exposição curto). No entanto, as câmeras monocromáticas só pode capturar um único canal de emissão (a detecção de um único fluoróforo) para coletar imagens. Sistemas de divisão de emissão de uma única câmara podem ser incorporados para captar vários canais de emissão, mas muitas vezes reduzir o campo de visão e exigem o mesmo tempo de exposição para a imagem de todos os canais. Para capturar o espectro de cores a partir de células marcadas com multiple fluoróforos, uma câmara de cor pode ser usado como alternativa. No entanto, câmeras de cor geralmente não são capazes de fornecer a resolução temporal desejado para imagens de células vivas em determinadas aplicações. Outro dispositivo de imagem é necessária para aplicações em que é vantajosa a imagem de células vivas em vários comprimentos de onda, mantendo uma alta resolução temporal. Uma aplicação experimental principal é o ensaio de adesão de câmara de fluxo de placas paralelas, em que as células são perfundidos em condições fisiologicamente relevantes sobre um substrato potencialmente reactiva 1, 3. As células em fluxo que expressam moléculas da superfície celular específicos podem aderir e rolo sobre o substrato, tal como uma monocamada de células que expressam as moléculas de adesão ou de proteínas extracelulares adsorvido à superfície da matriz 4, 5. Rolando células podem sofrer movimento de rotação e de translação em frações de segundo. Características moleculares sobre rolamento e células aderentes, tais como aglomerados de moléculas de superfície celular, também têm o potenciômetroal de sofrer reorganização activa na superfície da célula. Assim, sistemas de imagem deve fornecer uma resolução temporal excepcional (30 quadros por segundo ou mais, e "quase zero" tempos de exposição) para gerar uma seqüência de imagens que ilustra a progressão passo-a-passo de célula rolando 6, 7. Sistemas de divisão de emissão câmera dupla são capazes de atender a essas demandas para a imagem latente células marcadas com vários fluoróforos.
Sistemas de divisão de emissão câmera dupla dividir e canais de fluorescência do filtro em duas câmeras semelhantes de capturar simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicos de fluoróforo, mantendo o pleno campo de visão. Esta tecnologia permite a comparação direta da imagem capturada em tempo real em cada canal e permite ao usuário alternar rapidamente entre os modelos de câmeras com diferentes capacidades de imagem. Esse recurso é útil para fazer ajustes nas configurações de captura de imagem em uma câmera que melhor permitem que o sistema para capturarfluoróforos com diferentes intensidades, vidas, e coeficientes de extinção 8. Juntamente com o software de imagem, sistemas de divisão de emissão da câmera dupla permite a gravação em tempo real de ensaios de imagens de células vivas em vários comprimentos de onda e pode aumentar a ensaios in vitro que utilizam a fluorescência para estudar o comportamento das células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema de separação de emissão de câmara dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para capturar imagens de alta qualidade em aplicações onde a célula ou o movimento molecular é rápido. Em gerando os resultados representativos, os parâmetros do sistema de separação de emissão de câmara dupla, incluindo as configurações de software e as configurações da câmera, foram otimizados para obter uma sequência imagem mesclada em que rolamento e as células aderentes foram espacialmen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Douglas Goetz (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade Ohio) e Dr. Fabian Benencia (Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade Ohio) para discussões criteriosas e revisão do manuscrito. Agradecemos também o Dr. Christopher Huppenbauer para discussões úteis técnicas (W. Nuhsbaum Inc.). Este trabalho foi financiado por concessões do National Science Foundation (CBET-1106118) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
Referencias
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?. Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
