במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות
Summary
מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה למיקרוסקופ פלואורסצנטי שני צבעים ליצור רצפי תמונה בזמן אמת עם רזולוציה אופטית ובזמן חריג, דרישה של מבחני תא חי מסוימים, לרבות מבחני זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילות. כאשר תוכנה היא מועסק למזג תמונות מערוצי פליטה רכשו בו זמנית, רצפי תמונת pseudocolored מיוצרים.
Abstract
מיקרוסקופיה immunofluorescence צבע רב כדי לזהות מולקולות ספציפיות בקרום התא יכולה להיות בשילוב עם מבחני זרימת צלחת קאמריים במקביל לחקור את המנגנונים המסדירים את הידבקות תא בתנאי זרימה דינמיות. לדוגמא, ניתן perfused תאים הסרטניים שכותרתו עם fluorophores מרובה על פני מצע שעלול להיות תגובתי למודל מנגנונים של גרורות סרטניות. עם זאת, מערכות מצלמה אחת מרובה ערוצים ומצלמות צבע חסרונות תערוכה ברכישת תמונה לניתוח תא חי בזמן אמת. כדי להתגבר על המגבלות האלה, השתמשנו מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה כדי ללכוד בו זמנית רצפי תמונה בזמן אמת של תאים שכותרתו fluorescently בתא הזרימה. אורך גל מסנן מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה מוגדר נע לשתי מצלמות CCD בצבע אחד, ובכך בו זמנית ללכוד שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי. בהמשך לכך, תמונות אחד ערוצי psuedocolored משולבות לתוך אחדזמן אמת התמזג רצף שיכול לחשוף מולקולות מטרה מרובות בתאים עוברים במהירות על פני אזור של עניין.
Introduction
שיטות לניתוח של מולקולות על פני התא, כגון immunostaining, להעסיק בדיקות הכימיות מצומדת לfluorophores, המאפשרים זיהוי של מולקולות מטרה. הדמיה תא חי ומבחני הידבקות תא המבוסס על זרימה הידרודינמית נרשמים בדרך כלל עם מצלמות CCD מונוכרום נועדו ללכוד תהליכים פיסיולוגיים ברמה התאית ו / או מולקולרית 1, 2. מצלמות אלה הן מאוד רגישות, לספק שיעורים מהר מסגרת (יותר מ 30 פריימים לשניה), ולספק פתרון זמני חריג (עקב שיעורים מהר מסגרת וזמני חשיפה קצרה). עם זאת, מצלמות מונוכרום יכולות רק ללכוד ערוץ פליטה בודד (גילוי fluorophore יחיד) כדי לאסוף את התמונות. ניתן לשלב מערכות פיצול פליטת מצלמה אחת כדי ללכוד ערוצי פליטה מרובים, אך לעתים קרובות לצמצם את שדה הראייה ודורשות באותו זמן חשיפה להדמיה את כל הערוצים. כדי ללכוד את קשת צבעים מלאים מהתאים שכותרתו עם multiple fluorophores, מצלמה צבע יכולה לשמש כחלופה. עם זאת, מצלמות צבע הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק הרזולוציה של הזמן רצוי להדמית תא חי ביישומים מסוימים. מכשיר הדמיה נוסף נחוץ ליישומים בהם יש יתרון לתאי חי תמונה באורכי גל מרובה תוך שמירה על רזולוציה גבוהה זמנית. יישום ניסיוני ראש הוא assay המקביל תזרים צלחת קאמרי ההידבקות, שבו תאים הם perfused בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית על מצע פוטנציאלי תגובתי 1, 3. תאים בזרימה המבטאים את המולקולות בתא שטח ספציפיות עשויים לדבוק ומתגלגלים על המצע, כגון monolayer תא לבטא מולקולות הדבקות או חלבונים adsorbed משטח תאיים מטריקס 4, 5. תאים מתגלגלים עשויים לעבור תנועה סיבובית וtranslational בחלקיקים שניים. תכונות מולקולריות במתגלגלים ותאים חסיד, כגון צבירים של מולקולות בתא שטח, יש גם potentiאל לעבור ארגון מחדש פעיל על פני התא. לכן, מערכות הדמיה חייבות לספק פתרון זמני חריג (30 פריימים לשניה ומעלה ו" קרובים לאפס "זמני חשיפה) כדי ליצור רצף תמונה הממחיש את התקדמות צעד אחר צעד של התא מתגלגל 6, 7. מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה הן מסוגלים לעמוד בדרישות אלה לתאי הדמיה שכותרתו עם fluorophores מרובה.
מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה לפצל וערוצי הקרינה מסנן לשתי מצלמות דומות כדי ללכוד בו זמנית שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי תוך שמירה על השדה המלא של תצוגה. טכנולוגיה זו מאפשרת השוואה ישירה של התמונה שצולמה בזמן אמת בכל ערוץ ומאפשרת למשתמש לעבור במהירות בין דגמי מצלמות עם יכולות הדמיה שונות. תכונה זו שימושית לביצוע התאמות להגדרות לכידת תמונה במצלמה אחת שטוב יותר לאפשר למערכת כדי ללכודfluorophores עם עוצמות שונות, תקופות חיים, ומקדמי הכחדה 8. יחד עם תוכנת הדמיה, מערכות פיצול כפולה מצלמה פליטה מאפשרות הקלטה של מבחני הדמיה תא חיים באורכי גל מרובים בזמן אמת ועשויות לשפר את מבחני במבחנה המשתמשים בקרינה כדי ללמוד על התנהגות תא.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה יש הרזולוציה מרחבית, זמנית, ואופטית הדרושות כדי ללכוד תמונות באיכות גבוהות ביישומים שבם תא או תנועה מולקולרית הוא מהיר. ביצירת תוצאות הנציג, פרמטרים במערכת הכפולה פליטת המצלמה הפיצול, כולל הגדרות תוכנה והגדרות מצלמה, היו מותאמים כד?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר דאגלס גץ (מחלקה להנדסת כימית Biomolecular, אוניברסיטת אוהיו) וד"ר פביאן Benencia (מחלקה למדעים ביו, אוניברסיטת אוהיו) לדיונים מעמיקים וביקורת כתב יד. כמו כן אנו מודים לד"ר כריסטופר Huppenbauer לדיונים מועילים טכניים (W. Nuhsbaum Inc). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (CBET-1,106,118) והמכונים הלאומיים לבריאות (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
Referencias
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?. Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
