במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

Summary

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

תרבות איבר מספקת מודל שימושי שמגשר על הפערים בין מורכב, אך רלוונטי מאוד בחקירות vivo וסימולציה הנוחה אבל משוערת של מודלים קו סלולרי. במקרה של הלבלב, אין שורת תאים שווה ערך לחלוטין לאבות לבלב למרות שיש הופכים שורות תאים לדמות תאים האנדוקרינית ואקסוקרינית. כל הלבלב המבוגר לא יכול להיות מתורבת; איונים האנדוקרינית מבודדים יכולים להישמר במשך מספר שבועות ללא התפשטות תאים ויכולים להישמר פרוסות רקמה במבחנה לכמה שעות ^5. תרבות לבלב עוברי כבר בשימוש נרחב לא רק ללמוד הפיתוח שלה, אלא גם כדי לחקור אינטראקציות אפיתל-mesenchymal ^4,6,7, לתמונה מעבדת ⁸ או להתערב באופן כימי עימם ^9. שתי שיטות תרבות איבר משמשות בעיקר: הראשון מורכב בculturing ניצני לבלב על צלחות פיברונקטין מצופה ^2, שהוא convenient למטרות הדמיה; האפשרות השנייה היא תרבות האיברים במסננים בממשק האוויר הנוזלי ^3,4 השומר הכי טוב המורפוגנזה. למרות שמאוד שימושי, שיטות אלה יביאו למידה מסוימת של השטחה; ההתרחבות של אבות היא מוגבלת מאוד בהשוואה להתפתחות התקינה ולאוכלוסייה מתחילה מורכבת הכוללת את כל הסוגים של תאי לבלב ותאי mesenchymal.

יכולת התרבות ולהרחיב את התאים ראשוניים מפוזרים היא בעל ערך ללמוד יחסי שושלת ולחשוף את התכונות הפנימיות של סוגי תאים מבודדים ^10. סוגיאמה ואח' ^11. יכול לשמור על אבות לבלב ואת אבות האנדוקרינית שמרה על כמה דמויות פונקציונליות ל3-5 ימים בתרבות בשכבות מזין. Pancreatospheres, בדומה לneurospheres ¹² וmammospheres ^13, הורחב מאיונים למבוגרים ותאי ductal למרות שטבעו של האבות / תאי גזעשיוצרים תחומים אלה אינו ברור. בנוסף, בניגוד להתפתחות פיזיולוגית, pancreatospheres הכיל כמה נוירונים ^14,15. התחומים גם הופקו לאחרונה מאבות עובריים לבלב ^16,17 והתחדשות pancreata ¹⁸ עם התרחבות אב טובה והבחנה שלאחר מכן, אך לא הצליחו לשחזר המורפוגנזה.

המודלים 3D מהתאים מפוזרים ולעתים קרובות מוגדרים שעצמי לארגן את האיברים מוקטנים פרחו לאחרונה ולדמות את מחזור הפיתוח או מבוגר של איברים מרובים כגון המעי ^19,20, הקיבה ^21, הכבד ^22, הערמונית ²³ וקנה הנשימה ^24. במקרים מסוימים, המורפוגנזה והתמיינות התפתחותיים כבר סכמו ב3D מתאי גזע עובריים, כמו במקרה של כוסות אופטיות ^25, מעי ²⁶ או מוח ^27.

כאן, אנו describe שיטה להרחיב אבות לבלב multipotent ניתק בפיגום 3D Matrigel בו הם יכולים לבדל ולארגן את עצמו.

Protocol

פרוטוקול זה נועד לגדול organoids לבלב שמקורם E10.5 העכברי ניתק תאי לבלב אפיתל. הפרוטוקול דורש אישור אתי לניסויים בבעלי חיים. 1. Dissection של גב הלבלב באד מE10.5 עוברי עכברים <li style=";t…

Representative Results

אבות לבלב הגבי E10.5 ניתקו וזורעים ב3D Matrigel לסכם פיתוח לבלב. יכולים בקלות להיות בעקבות אבות עם כתבי ניאון. במקרה שלנו השתמשתי בעכבר מהונדס המבטא את חלבון ה-GFP הגרעינית הנשלט על ידי אמרגן Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (סרט 1) בהעדר טמוקסיפן ובכך ללא הפעלת Neurog3 4 (איור 2)…

Discussion

ייצור בקנה מידה גדולה של תאי הבטא תפקודיים במבחנה הוא עדיין לא יעיל ^1. בהקשר זה מאתגר, לימודי ביולוגיה התפתחותית עשויים לעזור בפענוח האותות המדויקים הנדרשים להתמיינות של תאי הבטא תפקודיים. פרוטוקול זה מאפשר לתחזוקה, ההתרחבות וההתמיינות של תאי אב עובריים ב?…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745