分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

Summary

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

器官培養は複雑であるが、生体内の調査で非常に関連性の高い細胞株モデルの便利なが、おおよそのシミュレーション間のギャップを橋渡しする有用なモデルを提供しています。内分泌および外分泌細胞を模擬した形質転換された細胞株が存在するが、膵臓例では、膵臓の前駆細胞と完全に同等のない細胞株ではありません。大人の膵臓全体を培養することができません。単離された内分泌膵島は数時間⁵ インビトロで維持することができる細胞増殖および組織切片なしで、数週間維持することができる。胚性膵臓培養物は、広くその発達を研究するためだけに使用されているだけでなく、上皮間葉相互作用^4,6,7を調査するために、画像に^8を処理または化学的にそれらと^9を妨害する。二つの器官培養法が主に使用されます。最初は都合のですフィブロネクチンコーティングしたプレート^2、上の膵臓芽を培養することにある画像化目的のためにnient;二つ目のオプションは文化に最も形態形成を保持する気液界面^3,4でフィルタの臓器です。非常に有用であるが、これらの方法は、ある程度の平坦化をもたらす;前駆細胞の拡大は非常に正常な発達および出発集団は、膵臓細胞および間葉細胞の全ての種類を含む複合体であると比べて制限される。

文化への能力と分散初代細胞を拡大し、系統関係を研究し、単離された細胞のタイプ¹⁰の固有の特性を明らかに価値がある。杉山ら ¹¹膵臓前駆細胞およびフィーダー層上の文化の中で3〜5日間いくつかの機能の文字を保持する内分泌前駆細胞を維持することができます。ニューロスフェア¹²と^13のマンモスフィアに似Pancreatospheresは、成人の島および前駆細胞/幹細胞の性質であるが管細胞から展開されてきたこれらの球体を生成することをすることは明らかではない。また、生理的発達とは対照的に、pancreatospheresは、いくつかのニューロンの^14,15を含ん^でいた。球はまた、最近、胚性膵臓前駆細胞^16,17と良好な前駆細胞の拡大とそれに続く分化と膵臓^18回生から生じたが、形態形成を再現できなかったし。

小型化された臓器に自己組織化分散させ、多くの場合、定義された細胞からの3Dモデルは、最近、繁栄し、そのような腸^19,20、胃^21、肝臓^22、前立腺^23、気管などの複数の器官の発達、大人の離職率をシミュレートしている^24。光学カップ^25、小腸²⁶または脳²⁷の場合のように、いくつかの例では、形態形成の発達および分化は、ES細胞から3Dにで要約されている。

ここでは、DES彼らは差別化と自己組織化することができる3Dマトリゲル足場に解離した多能性膵臓前駆細胞を拡大する方法をcribe。

Protocol

このプロトコルは、マウスE10.5から派生した膵臓オルガノイドが上皮膵臓細胞を解離した成長を目指しています。 プロトコルは、動物実験のための倫理的な承認を必要とする。 E10.5マウス胚から背膵芽の1。解剖ハサミで腹部を開き、胎生（E）10.5で時限妊娠マウスを犠牲に、2子宮角を削除し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはダルベ?…

Representative Results

3Dマトリゲルで解離し、播種E10.5の背側膵臓前駆細胞は、膵臓の発達を再現。前駆細胞は、最も容易に蛍光リポーターで追跡することができる。我々のケースでは（ 図2）NEUROG3 4を活性化することなく、タモキシフェンの非存在下では、したがって、Pdx1のプロモーター（、PDX1のNgn3-ER TM-nGFP）（動画1）によって制御された核GFPタンパク質を発現するトランス…

Discussion

インビトロにおける機能的β細胞の大規模生産は依然として¹無効である。このような厳しい状況では、発生生物学の研究で​​は、機能的なβ細胞の分化に必要とされる正確な信号を解読するに役立つことがあります。このプロトコルは、in vitroでの胚性膵臓前駆細胞の維持、拡大と差別化が可能になります。これは、他の内分泌ホルモンを共発現しないインスリン産生…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745