In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

Summary

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

Cultivo de órganos constituye un modelo útil que llena los huecos existentes entre la complejidad y relevancia es las investigaciones in vivo y la simulación conveniente pero aproximada de modelos de línea celular. En el caso del páncreas, no hay una línea de células perfectamente equivalente a progenitores páncreas aunque no se transforman líneas celulares que simulan células endocrinas y exocrinas. Todo el páncreas adulto no puede ser cultivado; aislados islotes endocrinos pueden mantenerse durante semanas sin la proliferación celular y rodajas de tejido se pueden mantener in vitro para algunas horas ^5. Cultura páncreas embrionario ha sido ampliamente utilizado no sólo para estudiar su desarrollo, sino también para investigar las interacciones epitelio-mesenquimal ^4,6,7, a la imagen procesa ⁸ o interferir químicamente con ellos ^9. Dos métodos de cultivo de órganos se utilizan principalmente: la primera consiste en el cultivo de brotes pancreáticos en placas de fibronectina recubierto ^2, que es conveniente para los propósitos de formación de imágenes; la segunda opción es la cultura de los órganos en los filtros en la interfase aire-líquido ^3,4 que mejor conserva la morfogénesis. Aunque muy útil, estos métodos conducen a un cierto grado de aplanamiento; la expansión de progenitores es muy limitado en comparación con el desarrollo normal y la población de partida es complejo que comprende todos los tipos de células pancreáticas y células mesenquimales.

La capacidad de la cultura y expandir las células primarias dispersas es valiosa para estudiar las relaciones de linaje y descubrir las propiedades intrínsecas de los tipos de células aisladas ^10. Sugiyama et al ^11. Podría mantener progenitores pancreáticos y células progenitoras endocrinas que conservaron algunos caracteres funcionales durante 3-5 días en cultivo en capas alimentadoras. Pancreatospheres, similar a neuroesferas ¹² y mammospheres ^13, se han ampliado de islotes adultos y células ductales aunque la naturaleza de los progenitores / células madreque generan estas esferas no está claro. Además, en contraste con el desarrollo fisiológico, los pancreatospheres contenían algunas neuronas ^14,15. Esferas también se produjeron recientemente a partir de progenitores páncreas embrionario ^16,17 y regenerar los páncreas ^{de 18 años} con una buena expansión de progenitores y posterior diferenciación pero no lograron recapitular la morfogénesis.

Modelos 3D a partir de células dispersas y, a menudo definidos que se auto-organizan en órganos miniaturizados han florecido recientemente y simular el desarrollo o un adulto facturación de múltiples órganos, como el intestino ^19,20, el estómago ^21, el hígado ^22, la próstata ²³ y la tráquea ^24. En algunos casos, la morfogénesis y la diferenciación del desarrollo se han recapitulado en 3D a partir de células ES, como es el caso de tazas ^25, el intestino ²⁶ o cerebrales ²⁷ óptica.

En este sentido, describir un método para expandir progenitores pancreáticos multipotentes disociadas en un andamio 3D Matrigel donde pueden diferenciarse y auto-organizarse.

Protocol

Este protocolo tiene como objetivo crecer organoides pancreáticas derivadas de E10.5 murino disociaron células epiteliales pancreáticas. El protocolo requiere la aprobación ética para la experimentación animal. 1. Disección de dorsal de páncreas Bud de E10.5 embriones de ratón Medio esencial Sacrificar los ratones oportuna embarazadas en el día embrionario (E) 10,5, abrir el abdomen con un par de tijeras, retire los dos cuernos uterinos y col…

Representative Results

Progenitores pancreáticos dorsal E10.5 disociados y sembradas en 3D Matrigel recapitular el desarrollo del páncreas. Progenitores pueden ser más fácilmente seguidos con reporteros fluorescentes. En nuestro caso hemos utilizado un ratón transgénico que expresa una proteína GFP nuclear controlada por el promotor Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Película 1) en ausencia de tamoxifeno y por lo tanto sin necesidad de activar NEUROG3 4 (Figura 2). …

Discussion

La producción a gran escala de células beta funcionales in vitro sigue siendo ineficaz ^1. En este contexto desafiante, estudios de biología del desarrollo pueden ayudar a descifrar las señales exactas que se requieren para la diferenciación de las células beta funcionales. Este protocolo permite el mantenimiento, expansión y diferenciación de células progenitoras pancreáticas embrionarias in vitro. Esto incluye la formación de células beta productoras de insulina que no co-expres…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745