Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy
Summary
Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche.
Abstract
PA Gele sind seit langem als Plattform, um die Zell Zugkräfte aufgrund der Herstellung und der Möglichkeit, sowohl ihre elastischen Eigenschaften zu erleichtern Studie verwendet worden. Wenn das Substrat mit einem extrazellulären Matrixprotein beschichtet ist, Zellen haften an dem Gel und gelten Kräfte, wodurch das Gel zu verformen. Die Verformung ist abhängig von der Zell Traktion und die elastischen Eigenschaften des Gels. Wenn der Verformungsbereich der Oberfläche bekannt ist, kann unter Verwendung von Oberflächentraktionselastizitätstheorie berechnet werden. Gel Verformung wird üblicherweise durch die Einbettung von fluoreszierenden Marker Perlen gleichmäßig in das Gel gemessen. Die Sonden zu verdrängen, wie das Gel verformt. Die Sonden in der Nähe der Oberfläche des Gels nachgeführt. Die von diesen Sonden berichtet Verschiebungen werden als Oberflächenverschiebungen berücksichtigt. Deren Tiefe von der Oberfläche, werden ignoriert. Diese Annahme stellt Fehler in Zugkraft Auswertungen. Für die präzise Messung von Zellkräften, ist es entscheidend für die Lage der Kugeln bekannt sein. Wir haben uns entwickelteine Technik, einfache Chemie verwendet, um fluoreszierende Markierungsperlen, 0,1 und 1 um Durchmesser zu beschränken, in PA-Gelen, innerhalb 1,6 um von der Oberfläche. Wir Mantel eine Deck mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierenden Beads. PA-Gel-Lösung wird dann zwischen dem Deckglas und einem haftenden Oberfläche angeordnet ist. Die fluoreszierende Kügelchen Transfer zum Gel-Lösung während der Aushärtung. Nach der Polymerisation enthält das PA-Gel fluoreszierende Kügelchen in ein Flugzeug in der Nähe der Gel-Oberfläche.
Introduction
Die mechanische Interaktion einer lebenden Zelle mit seinem lokalen Umfeld hat gemeinhin mit PA-Gele untersucht. Diese Substrate basieren auf einem einfachen, gut charakterisierten Protokoll von Dembo Wang 1997 1. Einer der Hauptvorteile dieser Substrate aufgebaut ist, dass ihre Steifigkeit kann durch Änderung der Konzentration bestimmter Bestandteile des Gel-Lösung eingestellt werden. Dies bietet eine Plattform, um Zellen wünschenswert 'Interaktion mit Umgebungen von unterschiedlichen Steifigkeiten zu studieren. Bei PA-Gele werden mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen beschichtet, Zellen haften an ihnen, Krafterzeugung. Als Ergebnis der Zellkraft, verformt sich das Gel als ein elastischer Körper. Diese Verformung ist abhängig von der Größe des durch die Zellen und die elastischen Eigenschaften des Gels aufgebrachte Kraft. Verschiedene Studien haben PA-Gele eingesetzt, um zelluläre Traktionskräfte zu untersuchen.
In einer Variation des PA-Gel Herstellung werden fluoreszierende Mikrosphären (Beads) eingebettet tberall das Gel auf Zell Zugkräfte auf Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten 2 zu quantifizieren. Nach Zellkraftanwendung, verdrängen die Perlen von ihrer ursprünglichen Lage nach Gel Deformation. Das Feld Verformung der einzelnen Wulst Verschiebungen gemessen. Diese Verformung Feld wird mit Elastizitätstheorie und die elastischen Eigenschaften des Gels, um die Zugkräfte berechnen genutzt. Diese Messungen geben Aufschluss darüber, wie Zellen mechanisch zu erfassen und die Interaktion mit den lokalen Mikroumgebung 3.
In vielen weit verbreiteten PA-Gel Herstellungsprotokolle werden die Perlen in der gesamten PA-Gel im flüssigen, nicht polymerisierten Zustand vermischt. Ein vollständig polymerisiert PA-Gel enthält fluoreszierende Kügelchen in seinem Volumen. Bei der Berechnung von Zelltraktionskräfte, sind Perlen die meisten in der Nähe der Gel-Oberfläche (Zell-Substrat-Schnittstelle) überwacht. Die Verschiebungen dieser Kügelchen werden als auf der Zellkulturoberfläche zur Vereinfachung der Kraft auftreten BERECHNUNGn. Die tatsächliche Position der Wülste innerhalb der Tiefe des Gels wird nicht berücksichtigt. Jedoch in einem elastischen Medium (wie PA-Gel), eine Wulst näher zu einem Kraftangriffspunkt bewegt sich mehr als ein Wulst, die weiter von dem Punkt entfernt ist. Somit Behandeln der Verschiebung eines Punktes (am Wulst Position) entfernt von der Oberfläche, wie die an der Oberfläche führt zu einer Unterschätzung der zellulären Zugkräfte. Der Fehlergrad ist abhängig vom Abstand der Schweißraupe an der Oberfläche. Der Fehler kann nicht ohne die Kenntnis der Lage der Wulst geschätzt werden.
Der Bedarf für ein einfaches Verfahren, um die Kügelchen in der Nähe des Zellkulturoberfläche beschränkt ist durch einige Techniken angegangen. Eine Möglichkeit ist es, die Dichte der Kügelchen während des gesamten Gels zu erhöhen, so dass es eine ausreichende Zahl der Raupen in der oberen Brennebene, um die Bewegung sehr nahe an der Oberfläche zu messen. Ein weiteres Verfahren beinhaltet den Aufbau eines konfokalen Abbildungskammer zur lebenden Zellen, so daß das Licht vonnur die Perlen in der obersten Bildebene gesammelt 4. Eine andere Methode besteht darin überlagern eine extrem dünne Schicht der PA-Gel mit Perlen auf eine bereits polymerisierte Gel ohne Perlen 5. Ein Nachteil jedes dieser Techniken ist, dass die genaue Lage der Kügelchen in dem Gel nicht bekannt ist. Dies bringt Fehler in die Berechnung der Verschiebungsfeld der Perlen und damit die Berechnung der Zellkräfte. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Konjugation von Kügelchen auf die Oberfläche eines bereits polymerisiert PA-Gel mit Sulfo-SANPAH 6. Diese Technik gewährleistet die Kügelchen sind in der Tat nur auf der Oberseite des PA-Gel, aber das Ausmaß, in dem sie in der Tiefe des Gels eingebettet sind, ist unbekannt. Dies könnte möglicherweise eine lokale Topographie für die Zellen, die das Zellverhalten verändern könnte, als vor der Arbeit hat vorgeschlagen, dass Zellen können mehrere Mikrometer Kraft weg 7 zu spüren. Kürzlich wurde eine Technik zum Mustern PA-Gelen mit 1 um Durchmesser fluorescent Fibronektin Punktmarkierungen in einem Array regularisiert wurde 8 etabliert. In diesem Fall wird die Tiefe der Fluoreszenzmarker bekannt, und ist im wesentlichen Null, da die Fibronektin Muster indirekt auf die Gel-Oberfläche gedruckt. Allerdings ist dieses Verfahren nicht eine kontinuierliche Umgebung, in der Zellen zu befestigen, wie das ECM-Protein ist mit 1 um Durchmesser Dots begrenzt. Ein Verfahren zum Tracker Perlen vollständige Integration in PA-Gelen und beschränken sie auf einem bekannten Ort ganz in der Nähe der Oberfläche muss noch erarbeitet werden.
Hier entwickeln wir eine Technik, um ein um bis um Durchmesser fluoreszierende Kügelchen zu einer Brennebene in der Nähe des Zellkulturfläche innerhalb PA-Gel zu beschränken. Ein Gel wird typischerweise durch Anordnen unpolymerisierten flüssigen Gel-Lösung zwischen zwei Glasplatten gehärtet. Eine der Platten wird funktionalisiert, so dass das Gel haftet stark zu. Die andere ist nicht funktionalisierten und nach der Gel härtet entfernt. Wir ändern dieses abnehmbare Glas sun-Schnittstelle durch Beschichten mit einer Schicht von Perlen. Auf, zwischen denen die flüssige Gel zwischen der funktionalisierten und dem Wulst beschichtete Glasoberfläche, die Perlen Transfer auf das Gel, während es der Aushärtung. Dies begrenzt die Entfernung der Perlen "Integration in das Gel in 1,6 um der Oberfläche. Glasbodenpetrischalen werden als Haftgrund, auf dem das Gel ausgehärtet wird verwendet. Um einen flachen oberen Gel-Oberfläche während der Polymerisation zu bilden, ist eine kreisförmige Deckglas zu Sandwich verwendet das Gel mit dem Glasbodenpetrischale. Gel vor der Herstellung wird die obere Deckglas mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet, wodurch eine positive Oberflächenladung. Die PDL wird mit Druckluft ausgeblasen, und eine Lösung von Perlen in Wasser auf die Deckgläser aufgebracht. Wir nutzen carboxylierten fluoreszierenden Mikrokügelchen, die eine negative Ladung tragen, und interagieren mit der positiv geladenen Oberfläche erstellt durch Behandlung mit PDL. Nach dem Ausblasen des Wulstes Lösung aus dem Deckglas mit Druckluft, eine einzelne Schicht ausPerlen bleibt elektrostatisch auf die Trockendeckglas verbunden. Der PDL-Beschichtung beeinträchtigt nicht die Haftung des Glases an der Geloberfläche, da die Glas-Objektträger nicht beschädigt und der PA-Gel vollständig intakt entfernt.
Die Glasbodenpetrischalen werden adhärenten durch Behandlung mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane und 0,5% Glutaraldehyd gemacht. PA-Gelen gewünschten Steifigkeiten werden durch Mischen von geeigneten Konzentrationen von Bisacrylamid und Acrylamid über ein Standard-Verfahren 9 erstellt. Ein Tropfen des Gels Lösung wird auf die Glasbodenpetrischale pipettiert. Das Deckglas, das die Kügelchen nach Sandwich verwendet das Gel mit der Petrischale. Wenn das Gel ausgehärtet ist, wird die obere Deckglas so dass die Kügelchen in der PA-Gel innerhalb 1,6 um von der Oberfläche entfernt eingebettet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei Verwendung dieser Technik ist es wichtig, dass der Wulst Lösung wird auf geeignete Weise verdünnt, und die Perlen werden auf der Basis gewünschten Durchmesser gewählt, PA Gelsubstrat Steifigkeit und der Größenskala der Phänomene, die in der gewünschten Experiment untersucht wird.
Vorsicht ist bei der Verdünnung der Lösung vor der Wulst Funktionalisierung oberen Glasplättchen genommen werden. Der Abstand zwischen den Wülsten auf der Gel-Oberfläche kann durch Veränderung der …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die interdisziplinäre Innovation Initiative Program der Universität von Illinois bestätigen, gewähren 12035. SK wurde UIUC von National Science Foundation (NSF) Zuschuss finanziert 0.965.918 IGERT: Ausbildung der nächsten Generation von Forschern in Zelluläre und Molekulare Mechanik und Bio-Nanotechnologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
Referencias
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