Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy
Summary
Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l'intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel.
Abstract
Gels PA ont longtemps été utilisés comme une plate-forme pour étudier les forces de traction cellulaire raison de la facilité de fabrication et la capacité d'ajuster leurs propriétés élastiques. Lorsque le substrat est revêtu d'une protéine de la matrice extracellulaire, les cellules adhèrent au gel et appliquent des forces, ce qui provoque le gel de se déformer. La déformation dépend de la traction de la cellule et les propriétés élastiques du gel. Si le champ de la surface de déformation est connu, la traction de la surface peut être calculée en utilisant la théorie de l'élasticité. Gel de déformation est généralement mesurée par incorporation de perles de marqueur fluorescent uniformément dans le gel. Les sondes déplacent que le gel se déforme. Les sondes proches de la surface du gel sont suivies. Les déplacements signalés par ces sondes sont considérés comme des déplacements de surface. Leurs profondeurs de la surface sont ignorés. Cette hypothèse introduit une erreur dans l'évaluation de la force de traction. Pour une mesure précise des forces de cellules, il est essentiel que l'emplacement des billes, qui sera appelée. Nous avons développéune technique qui utilise la chimie simple de limiter les perles de marqueurs fluorescents, 0,1 et 1 pm de diamètre, dans des gels d'AP, à l'intérieur de 1,6 pm de la surface. On couche une lamelle couvre-objet avec du poly-D-lysine (PDL) et des billes fluorescentes. Solution de gel PA est alors pris en sandwich entre la lamelle et une surface adhérente. Les billes fluorescentes pour transférer la solution de gel au cours du durcissement. Après polymérisation, le gel contient des billes fluorescentes PA sur un plan proche de la surface du gel.
Introduction
L'interaction mécanique d'une cellule vivante avec son environnement local a souvent été étudiée en utilisant des gels de l'AP. Ces substrats reposent sur un protocole simple et bien établi caractérisé par Wang et Dembo en 1997 1. L'un des principaux avantages de ces substrats est que leur rigidité peut être ajustée en modifiant les concentrations des composants spécifiques de la solution de gel. Ceci fournit une plate-forme souhaitable d'étudier l'interaction des cellules avec des environnements de rigidités différentes. Lorsque gels PA sont recouvertes d'matrice extracellulaire de protéines (ECM), les cellules adhèrent à eux, de génération de force. En raison de la force de la cellule, le gel se déforme comme un corps élastique. Cette déformation dépend de la grandeur de la force appliquée par les cellules et les propriétés élastiques du gel. Diverses études ont utilisé des gels PA pour enquêter sur les forces de traction cellulaires.
Dans une variante de PA gel fabrication, microsphères fluorescentes (perles) sont intégrés tout au long de gel de quantifier les forces de traction cellulaire sur des gels de différentes rigidités 2. Lors de l'application de la force de la cellule, les billes déplacent à partir de leur position initiale après une déformation de gel. Le champ de déformation est mesurée à partir des déplacements individuels de talons. Cette zone de déformation est utilisé par la théorie de l'élasticité et les propriétés élastiques du gel de calculer les forces de traction. Ces mesures permettent de mieux comprendre la façon dont les cellules détectent et interagissent avec leur micro-environnement local 3 mécaniquement.
Dans de nombreux protocoles gel de fabrication largement utilisées PA, les perles sont mélangées à travers le gel PA dans son état liquide, non polymérisé. Un gel PA entièrement polymérisé contient des billes fluorescentes dans tout son volume. Lorsque le calcul de forces de traction de la cellule, la plupart des perles près de la surface du gel (de l'interface cellule-substrat) sont surveillés. Les déplacements de ces billes sont supposées se produire sur la surface de culture cellulaire pour la simplicité de la force CALCULn. La position réelle des perles au sein de la profondeur du gel n'est pas respectée. Cependant, dans un milieu élastique (tel que le gel PA), un cordon plus proche d'un point d'application de la force se déplace plus d'un bourrelet qui est plus éloignée de la pointe. Ainsi, le traitement du déplacement d'un point (à l'emplacement du bourrelet) distale par rapport à la surface que celle de la surface conduit à une sous-estimation des tractions cellulaires. Le degré d'erreur dépend de la distance de la bille à partir de la surface. L'erreur ne peut être estimée à l'insu de l'emplacement du cordon.
Le besoin d'une méthode simple pour limiter les perles très près de la surface de culture cellulaire a été traitée par plusieurs techniques. Un moyen consiste à augmenter la densité des billes de gel tout au long de telle sorte qu'il y ait un nombre suffisant de billes dans le plan focal supérieur à mesurer le mouvement très près de la surface. Une autre technique consiste à construire une chambre d'imagerie confocal pour l'imagerie des cellules vivantes de telle sorte que la lumière provenant deseules les billes dans le plan focal le plus supérieur est recueilli 4. Une autre méthode consiste à superposer une couche extrêmement mince de gel PA contenant des billes sur le dessus d'un gel déjà polymérisé sans billes 5. Un inconvénient de chacune de ces techniques est que l'emplacement précis des billes dans le gel n'est pas connue. Cela introduit une erreur dans le calcul du champ de déplacement des billes, et donc le calcul des forces de cellules. Une autre technique consiste à conjugaison de billes à la surface supérieure d'un gel PA déjà polymérisé en utilisant sulfo-SANPAH 6. Cette technique assure les billes sont en effet uniquement sur la partie supérieure du gel PA, mais la mesure dans laquelle elles sont noyées dans l'épaisseur du gel est inconnu. Cela pourrait créer une topographie locale pour les cellules, ce qui pourrait modifier le comportement de la cellule, comme un travail préalable a suggéré que les cellules peuvent sentir la force de quelques microns de distance 7. Récemment, une technique de structuration gels PA avec 1 um de diamètre fluorescent marqueurs fibronectine de points dans un tableau régularisée a été créé 8. Dans ce cas, la profondeur des marqueurs fluorescents est connu, et est pratiquement nul, car le motif de la fibronectine est indirectement imprimé sur la surface du gel. Cependant, cette méthode ne fournit pas un environnement continu sur lequel les cellules peuvent se fixer, comme la protéine d'ECM est limitée à 1 um de diamètre des points. Une méthode pour intégrer pleinement les perles tracker dans des gels d'AP et les confiner dans un endroit connu de très près de la surface n'a pas encore été établie.
Ici, on développe une technique pour contraindre sous-um de diamètre de billes fluorescentes um à un plan focal à proximité de la surface de culture cellulaire à l'intérieur de gel PA. Un gel est habituellement durci par solution en sandwich de gel liquide non polymérisé entre deux plaques de verre. Une des plaques est fonctionnalisé de sorte que le gel adhère fortement à elle. L'autre est non fonctionnalisé et est retiré après les cures de gel. Nous modifions ce verre amovible surface en le revêtant avec une couche de billes. Lors de la prise en sandwich entre le gel liquide fonctionnalisé et la surface de verre revêtue de talon, le transfert des billes de gel pendant qu'il durcit. Cela limite la distance de l'intégration des perles dans le gel à 1,6 um de la surface. Plats de Pétri à fond de verre sont utilisés en tant que la surface adhérente sur laquelle le gel est durci. Pour former une surface supérieure plate de gel au cours de la polymérisation, une lamelle circulaire de verre est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri à fond de verre. Avant de gel fabrication, le couvercle en verre haut glissement est recouvert de poly-D-lysine (PDL), ce qui donne une charge de surface positive. Le PDL est soufflé avec de l'air comprimé, et une solution de billes dans l'eau est déposée sur les lamelles. Nous utilisons des microbilles fluorescentes carboxyles, qui portent une charge négative, et d'interagir avec la surface chargée positivement créé par traitement avec PDL. Après soufflage de la solution de talon de la lamelle couvre-objet avec de l'air comprimé, une seule couche deperles demeure électrostatique couplé à la lamelle sec. Le revêtement PDL n'affecte pas l'adhérence du verre à la surface du gel, comme les lames de verre sont en bon état et présente dans le gel PA intact.
Les boîtes de Pétri à fond de verre sont faites adhérente par un traitement avec 97% de 3-aminopropyl-trimethoxysliane et 0,5% de glutaraldéhyde. Gels PA de rigidités souhaités sont créés en mélangeant des concentrations appropriées de bisacrylamide et d'acrylamide par une procédure standard 9. Une goutte de la solution de gel est introduit à la pipette sur la boîte de Pétri à fond de verre. La lamelle couvre-objet en verre contenant les billes est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri. Lorsque le gel est durci, le couvercle supérieur est enlevé, laissant glisser les perles noyées dans le gel à l'intérieur de PA 1,6 um à partir de la surface.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant cette technique, il est essentiel que la solution de talon est correctement dilué et les perles sont choisies en fonction du diamètre désiré, la rigidité du substrat PA de gel, et l'échelle de la taille des phénomènes qui sont explorées dans l'expérience souhaitée.
Il faut être prudent lors de la dilution de la solution de billes avant fonctionnalisation top des lamelles de verre. L'espacement entre les billes sur la surface du gel peut être modifiée en…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Programme Initiative interdisciplinaire de l'innovation, de l'Université de l'Illinois, 12035 accorder. SK a été financé à UIUC de la National Science Foundation (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Former la prochaine génération de chercheurs en mécanique moléculaire et cellulaire et Bionanotechnology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
Referencias
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