تقييم-التسلل ورم خلايا الدم البيضاء مجموعات فرعية في ورم تحت الجلد نموذج
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
الخلايا المناعية المتخصصة التي تتسلل المكروية الورم تنظم نمو وبقاء الأورام. الخلايا الخبيثة يجب أن يراوغ أو تخريب المضادة للورم الاستجابات المناعية من أجل البقاء على قيد الحياة وتزدهر. الأورام الاستفادة من عدد من آليات مختلفة من المناعة "الهروب"، بما في ذلك تجنيد مولد للتحمل DC، وخلايا T التنظيمية المثبطة للمناعة (Tregs)، والخلايا القامع المستمدة النخاعي (MDSC) التي تمنع الردود المضادة للورم السامة للخلايا. وعلى العكس، يمكن أن الخلايا المناعية المضادة للورم المستجيب إبطاء نمو وتوسع الأورام الخبيثة: الخلايا الجذعية مناعة، الخلايا القاتلة الطبيعية التي ترعى الفطرية الحصانة المضادة للورم، والخلايا التائية السامة يمكن للجميع المشاركة في قمع الورم. التوازن بين المؤيدين والمضادة للورم الكريات البيض يحدد في نهاية المطاف سلوك ومصير الخلايا تحولت، وتحملت العديد من الدراسات السريرية الإنسان ذلك. وهكذا، تحليلا مفصلا لمجموعات فرعية الكريات البيض داخلأصبح المكروية ورم متزايد الأهمية. هنا، نحن تصف طريقة لتحليل مجموعات فرعية الكريات البيض التسلل الحالية في المكروية الورم في نموذج الورم الماوس. تم تلقيح الماوس B16 خلايا الورم القتامي تحت الجلد في C57BL / 6 الفئران. في وقت معين، ومقطوعة الأورام والجلد المحيط ككل ومعالجتها في تعليق خلية واحدة، ثم جرى الملون لمتعددة الألوان التدفق الخلوي. باستخدام مجموعة متنوعة من الكريات البيض علامات فرعية، كنا قادرين على المقارنة بين النسب المئوية النسبية للتسلل مجموعات فرعية الكريات البيض بين السيطرة والأورام، معربا عن chemerin. المحققون قد تستخدم هذه الأداة لدراسة وجود المناعة في المكروية الورم وعندما يقترن قياسات حجم الفرجار التقليدية للنمو الورم، من المحتمل أن تسمح لهم لتوضيح أثر التغيرات في تكوين المناعة على نمو الورم. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نموذج الورم الذي الورم والمكروية ج لهاويتم مقطوعة ومعالجتها.
Introduction
التوازن بين نمو الورم وتعزيز والانحدار هو، في جزء منه، يعتمد على ميزان الورم التسلل الكريات البيض المؤيدة والمضادة الموجودة في المكروية 1،2. من أجل دراسة المكروية الورم (TME) وتحديدا التعرف على مجموعات سكانية فرعية التسلل الكريات البيض، قمنا بتطوير طريقة لتقييم الأورام تحت الجلد في نموذج الورم الفئران. أهمية دراسة المكروية الورم هو معروف جيدا ودعمت في الأدب. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن ميزان المؤيدين والمضادة للورم تسلل الخلايا المناعية يمكن أن تؤثر على نتائج نمو الورم، وليس فقط في الماوس ولكن أيضا الدراسات الإنسانية (التي استعرضت في 3،4). على سبيل المثال، كورييل وآخرون أظهرت أن ساءت كانت مرتبطة النتائج السريرية في المرضى الذين يعانون سرطان المبيض مع وجود زيادة النسب المئوية للخلايا الورم التسلل التنظيمية CD4 + T (Tregs) 5. أظهر عملنا الخاص أيضا تأثير لاانخفض فيل الكريات البيض جاذب كيميائي على نسبة من مجموعات فرعية الكريات البيض في نموذج الفأر سرطان الجلد 6، والتي ترتبط أيضا مع نمو الورم. وهكذا، والآن يعترف تحليلات مفصلة لمجموعات فرعية الكريات البيض داخل الورم بشكل أوسع وذات أهمية متزايدة.
هناك العديد من الطرق لتقييم المكروية الورم لالتسلل الكريات البيض. وهندسيا على سبيل المثال مجموعات الفئران المعدلة وراثيا للتعبير عن مختلف البروتينات الفلورية من أجل صورة TME 7، المناعية الكلاسيكية والمناعي للأقسام الحفاظ 8، بما في ذلك طرائق التصوير المختلفة مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، الفحص المجهري متحد البؤر 9-11 – بعض، مع القدرة على مراقبة intravitally 10،12. هذه يمكن استخدامها مع مختلف وكلاء التصوير الجزيئي، مثل الجسيمات النانوية 13 أو عوامل التباين رواية 14 أن تسمية الخلايا المناعية. أسلوبنا هو النهج القائم على التدفق الخلوي، ولها العديد من المزايا.أولا، المكروية الورم بالكامل ويمكن أخذ عينات. في وقت التحليل، ومقطوعة الورم تحت الجلد كله والأطراف المحيطة جراحيا للمعالجة. هذا يلغي أي تحيز يحتمل أخذ العينات داخل الورم واحد ويعطي تحليلا أكثر "العالمي" للورم ككل. ثانيا، وذلك باستخدام التدفق متعدد الألوان الخلوي لتحليل مجموعات فرعية الكريات البيض يسمح لنا لقياس أكثر تحديدا النمط الظاهري من الكريات البيض التسلل. اعتمادا على عدد من الألوان المستخدمة، ويمكن تحديد مجموعات فرعية محددة للغاية. وهذا أمر مهم كما أن هناك عدة مجموعات فرعية الكريات البيض ضمن نوع من الخلايا معين – أو حتى في تصنيف فرعي العام – التي لها وظائف المتباينة التي يحتمل أن تكون هامة في تحديد مصير الورم. على سبيل المثال، الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (PDC) قد تورطت في المضادة للورم الحصانة 15. ومع ذلك، فقد أظهرت CCR9 + فرعية من PDCS أن يكون مولد للتحمل 16، وتحول مكتبة الإسكندريةانس هذه مجموعة فرعية قد يكون لها تأثير على نمو الورم.
أسلوبنا هو مناسب لتحت الجلد أو الأورام الأخرى التي يمكن مقطوعة جملة. في أيدينا، والأورام مقطوعة بشكل موحد في وقت القتل الرحيم. ومع ذلك، فمن المتصور، كما حدث في بعض الدراسات، أن وجود ورم تحت الجلد يمكن مقطوعة تماما مع إغلاق الجلد المحيطة بها في عملية جراحية بقاء 17، مما يتيح تقييم إضافي للحيوان. ثم يتم إجراء التحليل على الورم مقطوعة. وهكذا، فإن النتائج تمثل timepoint واحد في تنمية الورم. في حين أن هذا يسمح نظرة مفصلة في المكروية، بل هو أيضا صورة ثابتة من ما لا شك فيه عملية ديناميكية. ومع ذلك، الكريات البيض معزولة (على سبيل المثال عن طريق المغناطيسي الانفصال أو التدرج الكثافة) ثم يمكن تحليلها بشكل منفصل عن ظهائر الورم وسدى، أو استخدامها في أخرى، المقايسات الفنية لزيادة تحديد النمط الظاهري، وكما كان PREVIصفت سابقا 18. هذه الطريقة، ثم، سيكون مفيدا لأي المحققين المهتمين في فهم تكوين الكريات البيض داخل المكروية الورم في مرحلة زمنية معينة، سواء في الإعداد للدورة مرض طبيعي، أو بعد اضطراب علاجي معين. وإن لم يكن ذلك من قبلنا، ويمكن أيضا أن من المحتمل أن تستخدم أشكال مختلفة من هذا الإجراء لتحليل أجزاء محددة من ورم في عزلة. على سبيل المثال، نظرا لحجم الورم، والمنطقة الطرفية (ق) يمكن تشريح بعيدا عن المركزية، الأساسية ربما الناخر للورم لإعطاء الباحث وجهة نظر أكثر يعزلون مكانيا من المكروية الورم.
في مجال المزدهرة من ورم علم المناعة، وسوف يكون هناك شك في عدد متزايد باطراد من دراسات تقييم عوامل المناعية رواية في نماذج الفئران الورم. وقد أبرزت عدة تقارير الاختلافات في وظيفة الكريات البيض محددة داخل الورم مقابل الطرفية ENvironment و. على سبيل المثال، أظهرت شيفر-ويفر آخرون في نموذج الفأر أن مستضد معين T المستجيب CD8 + الخلايا، في حين تنشط في محيط، تم تحويلها إلى CD8 + T خلايا القامع بمجرد الاتجار بهم في المكروية ورم 19. كان هذا في جزء منه بسبب TGFβ، ولكن العوامل الأخرى التي يحتمل وتشارك كذلك. وهكذا، وتقييم مجموعات فرعية الكريات البيض – الأرقام والنسب، وكذلك الوضع الوظيفي – داخل الورم في حد ذاته سوف تعطي تمثيل أكثر دقة للتأثير تعديل مناعي خاص على مصير الورم.
تقنية تسمح لنا تحليلا مفصلا للورم، وتوفر للباحث فرصة لتحديد أكثر عن كثب التغيرات في السكان الكريات البيض من المناهج السابقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
إجراء تحليل مفصل للالمكروية الورم أمر بالغ الأهمية في تحديد آليات وآثار تعديل مناعي. مع وجود زيادة من immunotherapeutics في المجال السريري البشري، فهم تأثير هذه العوامل على الورم التسلل الكريات البيض أصبح شرطا في تحديد آلية عملها. في البشر، وهناك كثير من الأحيان وجود صعوبات ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة R01-CA169354 وR01-047822 من المعاهد الوطنية للصحة وجائزة تقدير من وزارة شؤون المحاربين القدامى (ECB). وأيد RKP من قبل المعاهد الوطنية للصحة T32 CA009287-30A1، وهي جائزة الباحث ASCO يونغ، كاليفورنيا سرطان الثدي بحوث زمالة مشروع، وجمعية السرطان الأمريكية إرشادهم بحوث الباحث غرانت. وأيد BAZ من قبل منحة AI079320 NIH. وأيد JM التي كتبها المنح الدراسية من المعاهد الوطنية للصحة T-32 منحة تدريبية T32-AI07290- 25، T32-AI07290-24 وجمعية السرطان الأمريكية زمالة ما بعد الدكتوراه PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Referencias
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
