Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Gespecialiseerde immuuncellen die de tumor micro infiltreren reguleren de groei en overleving van neoplasie. Kwaadaardige cellen moet ontwijken of te ondermijnen anti-tumor immuunrespons om te overleven en te bloeien. Tumoren maken van een aantal verschillende mechanismen van het immuunsysteem "escape", waaronder de werving van tolerogene DC, immunosuppressieve regulerende T-cellen (Tregs) en myeloide suppressor cellen (MDSC) dat cytotoxische anti-tumor responsen te remmen. Immunostimulerende dendritische cellen, natuurlijke killer cellen die aangeboren anti-tumor immuniteit haven en cytotoxische T-cellen allemaal kunnen deelnemen aan tumorsuppressie: Omgekeerd kunnen anti-tumor effector immuuncellen de groei en uitbreiding van maligniteiten vertragen. De balans tussen pro- en anti-tumor leukocyten bepaalt uiteindelijk het gedrag en het lot van de getransformeerde cellen; een veelheid van menselijke klinische studies hebben aangetoond dit uit. Zo, gedetailleerde analyse van leukocyten subsets binnende tumor micro-omgeving is steeds belangrijker geworden. Hier beschrijven we een werkwijze voor het analyseren infiltrerende leukocyten subsets aanwezig in de tumor micro-omgeving in een muizen tumormodel. Muis B16 melanoma tumorcellen werden subcutaan geïnoculeerd in C57BL / 6 muizen. Op een bepaald tijdstip, werden tumoren en de omliggende huid weggesneden en bloc en in enkele cel suspensies, die vervolgens werden gekleurd voor multi-color flowcytometrie verwerkt. Hand van diverse leukocyten deelverzameling markers, konden we de relatieve percentages van infiltrerende leukocyten subsets tussen controle en chemerin expressie tumoren vergelijken. Onderzoekers kunnen dergelijke gebruiken om de immune aanwezigheid in de tumor micro-omgeving en in combinatie met traditionele schuifmaat maat metingen van tumorgroei, zal mogelijk kunnen zij het effect van veranderingen in immune samenstelling op tumorgroei helderen bestuderen. Een dergelijke techniek kan worden toegepast op elk tumormodel waarin de tumor en de micro Ceen worden gereseceerd en verwerkt.
Introduction
Het evenwicht tussen groei en bevordering tumor regressie is gedeeltelijk afhankelijk van de balans tussen pro- en anti-tumor-infiltrerende leukocyten aanwezig in de micro 1,2. Om de tumor micro studie (TME) en specifiek de infiltrerende leukocyten subpopulaties, ontwikkelden we een methode voor de evaluatie van subcutane tumoren in een murine tumormodel. Het belang van het bestuderen van de tumor micro-omgeving is bekend en ondersteund in de literatuur. Talrijke studies hebben aangetoond dat de balans van pro- en anti-tumor infiltrerende immuuncellen kan invloed hebben op de resultaten van tumorgroei, niet alleen in muizen maar ook menselijke studies (besproken in 3,4). Bijvoorbeeld Curiel et al. Toonde aan dat verslechterd klinische resultaten bij eierstokkankerpatiënten werden gecorreleerd met de aanwezigheid van toenemende percentages van tumor-infiltrerende regulerende CD4 + T-cellen (Tregs) 5. Onze eigen werk toonde ook het effect van een nietvel leukocyt chemoattractant van de verhouding van leukocyt populaties in een muizen melanoma model 6, die ook gecorreleerd met verminderde tumorgroei. Zo wordt de gedetailleerde analyses van de leukocyten subsets binnen een tumor nu breder erkend en steeds belangrijker.
Er zijn vele manieren om de tumor micro-omgeving voor het infiltreren van leukocyten te evalueren; bijvoorbeeld groepen hebben transgene muizen ontworpen om verschillende fluorescerende eiwitten om het imago van de TME 7, klassieke immunohistochemie en immunofluorescentie van conserven secties 8, met inbegrip van verschillende beeldvormende modaliteiten zoals MRI, PET, confocale microscopie 9-11 uitdrukken – sommige met de mogelijkheid om monitoren intravitally 10,12. Deze kunnen worden gebruikt met verschillende moleculaire beeldvormende middelen, zoals nanodeeltjes 13 of nieuwe contrastmiddelen 14 dat immuuncellen label. Onze werkwijze is een flowcytometrie-aanpak en heeft verschillende voordelen.Ten eerste kan de gehele tumor micro-omgeving worden bemonsterd; bij de analyse, wordt de gehele subcutane tumor en omliggende rand chirurgisch weggesneden voor verwerking. Dit elimineert potentieel bemonsteren voorspanning in één tumor en geeft een "globale" analyse van de tumor als geheel. Ten tweede gebruikt multicolor flowcytometrie de leukocyt subgroepen te analyseren kunnen we meer specifiek meten het fenotype van infiltrerende leukocyten. Afhankelijk van het aantal gebruikte kleuren kunnen zeer specifieke subsets worden geïdentificeerd. Dit is belangrijk omdat er verschillende leukocyt subgroepen binnen een bepaald celtype – of zelfs een subtype algemene classificatie – dat uiteenlopende functies kunnen aanzienlijk het bepalen van het lot van de tumor. Zo hebben plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) betrokken bij anti-tumor immuniteit 15. Echter, de CCR9 + subset van pDCs is aangetoond dat tolerogene 16 en verschuiven van de balans van zo'n sub invloed kunnen zijn op tumorgroei.
Onze werkwijze is geschikt voor subcutane of andere tumoren die kunnen worden weggesneden en bloc. In onze handen werden tumoren gelijkmatig gereseceerd bij de euthanasie. Het is echter denkbaar, zoals is gedaan in een aantal studies, dat een subcutane tumor volledig kon worden uitgesneden met sluiting van de omringende huid in een overleving operatie 17, waardoor extra evaluatie van het dier. De analyse wordt dan uitgevoerd op het gereseceerde tumor. Dus de resultaten vormen een tijdstip in de ontwikkeling van de tumor. Hoewel dit kan een gedetailleerd blik in de micro-omgeving, maar ook een statisch beeld van wat ongetwijfeld een dynamisch proces. Echter, geïsoleerde leukocyten (bijvoorbeeld via magnetische afscheiding of dichtheidsgradiëntcentrifugatie) kan vervolgens afzonderlijk worden geanalyseerd vanuit de tumor epitheel en stroma, of gebruikt worden in andere, functionele assays om hun fenotype verder te definiëren, zoals Previ geweestDUREND beschreven 18. Deze methode zou dan nuttig voor onderzoekers geïnteresseerd in het begrijpen van de samenstelling van de leukocyten in de tumor micro-omgeving op een bepaald tijdstip, ongeacht of in de omgeving van het natuurlijke ziekteverloop of na een bepaalde therapeutische verstoring. Hoewel niet door ons, variaties van deze procedure kan ook eventueel worden gebruikt om specifieke delen van een tumor afzonderlijk analyseren. Gegeven bijvoorbeeld de grootte van de tumor, de randzone (s) worden van de centrale, mogelijk necrotische kern van de tumor ontleed de onderzoeker een ruimtelijk gescheiden gezien de tumor micro geven.
In de snel groeiende gebied van de tumor immunologie, zal er ongetwijfeld een exponentieel groeiend aantal studies evalueren van immunomodulerende verbindingen in muizen tumor modellen. Verschillende rapporten hebben de verschillen in specifieke leukocytfunctie gemarkeerd in de tumor ten opzichte van de perifere enving. Bijvoorbeeld Shafer-Weaver et al. Toonden in een muismodel dat antigeen-specifieke effector T CD8 + cellen, terwijl actief in de periferie, werden getransformeerd in CD8 + T-suppressor-cellen eenmaal verhandeld in de tumor micro-omgeving 19. Dit was gedeeltelijk te wijten aan TGFO, maar ook andere factoren zijn waarschijnlijk betrokken ook. Aldus evalueren leukocyt subgroepen – getallen en verhoudingen, alsmede functionele status – binnen de tumor zelf een nauwkeurigere voorstelling van het effect van een bepaalde immunomodulatie op tumor lot geven.
De techniek maakt gedetailleerde analyse van de tumor en geeft de onderzoeker de mogelijkheid om veranderingen in leukocyt populaties dan eerdere benaderingen beter identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het uitvoeren gedetailleerde analyse van de tumor micro kritisch bepalen van de mechanismen en gevolgen van immunomodulatie. Met de toenemende aanwezigheid van immunotherapeutische in de menselijke klinische rijk begrijpen van de invloed van deze middelen op de tumor infiltrerende leukocyten steeds vereiste vaststelling van hun werkingsmechanisme. Bij mensen bestaan vaak klinische en / of logistieke problemen bij het verkrijgen en analyseren van tumorweefsel voor leukocyt deelanalyse en daarmee analyse van de peri…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies R01-CA169354 en R01-047822 van de National Institutes of Health en een Merit Award van het Department of Veterans Affairs (ECB). RKP werd ondersteund door NIH T32 CA009287-30A1, een ASCO Young Investigator Award, Californië Breast Cancer Research Project Fellowship en een American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ werd ondersteund door NIH-subsidie AI079320. JM werd ondersteund door beurzen van NIH T-32 training subsidie T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 en American Cancer Society post-doctorale beurs PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Referencias
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
