ウイルス媒介標識およびための内側神経節隆起（MGE）の移植は、細胞<em>インビボ</em>研究
Summary
GABA作動性皮質介在ニューロンの前駆細胞は、移植後のホスト皮質に統合シナプスの開発と、分散させる。これらの細胞は、容易に遺伝的に改変されたGABA作動性前駆体のインビボでの研究のために、移植前に形質導入することができる。ここでは、既存のCreラインとCre依存レポーターを使用して、特定の介在ニューロンのサブグループをターゲットとするウイルス性標識技術を示している。
Abstract
胚の内側と尾側神経節隆起（MGE及びCGE）由来のGABA作動性皮質介在ニューロンは、機能的および形態学的に多様である。進出が別個の皮質ニューロンのサブグループの役割を理解する上でなされているが、GABA作動性細胞の異なるタイプの発生および成熟に寄与し得る働いする多くのメカニズムがまだある。また、変更されたGABA作動性シグナル伝達は、自閉症、統合失調症およびてんかんの表現型に寄与し得る。具体的なのCre-ドライバーラインはユニークな介在ニューロンのサブグループの機能を実行小包し始めている。マウスモデルにおける進歩にもかかわらず、効率的に、インビボでの分子アプローチとGABA作動性、皮質介在ニューロン前駆細胞を研究することはしばしば困難である。これらの細胞の細胞自律的なプログラミングを研究するために使用される一つの重要な技術は、宿主皮質にMGE細胞の移植である。これらの移植細胞は、差別化、広範囲に移動するND機能的に統合する。また、MGE細胞を効率的に分子アプローチの多数を可能にする、移植の直前にレンチウイルスで形質導入することができる。ここでは詳細に効率よく利用できるのCreドライバライン及びCre依存の発現ベクターを用いて、in vivoでの分析のために、移植前にMGE細胞を形質導入するためのプロトコル。それは大きなインビボ細胞型特異的解像度を可能にする、移植後に分散させるためにこれらの細胞の能力を正確に遺伝子操作を組み合わせるので、このアプローチは有利で ある。
Introduction
残りは、興奮性グルタミン酸作動性に主ニューロンに対応しながら、GABA作動性、皮質介在ニューロンは、哺乳動物の新皮質におけるニューロンの〜20-30％を含む。介在ニューロンは、1をターゲットに軸索と樹状突起の形態およびシナプス電気生理学的特性において非常に多様であり、興奮性/抑制性トーンの不均衡は、自閉症、統合失調症やてんかん2を含む神経/精神神経疾患のいくつかの表現型の根底にあると仮定される。本明細書に記載されたプロトコルの全体的な目標は、効率的に、遺伝的にin vivoでの分析のために、移植前GABA作動性、皮質介在ニューロン前駆細胞を変更する手段を提供することである。
皮質GABA作動性介在ニューロンは、内側と尾側神経節隆起（MGE及びそれぞれCGE、）3,4と同様に視索前野5で生まれている。皮質介在ニューロン前駆細胞は、長距離接線の移行が続い受けるラジアル移行により、最終的な目標に到達する。彼らの目的地に到着すると、これらの皮質介在ニューロンが正しく、既存の神経細胞のネットワークに統合する必要があり、それぞれの固有の介在ニューロンのサブグループは、特定の方法で皮質回路に貢献していきます。 4つの主なサブグループは、分子マーカーによって識別することができます。MGE由来ソマトスタチン（SST）+及びパルブアルブミン（PV）+サブグループ、およびCGE由来血管作動性腸管ペプチド（VIP）+とリーリン+; SST –サブグループ6。異なる皮質介在ニューロンのサブグループは、MGE及びCGE 7,8における胚発生の間、異なる時間にわたって生まれている。これらおよび他の皮質GABA作動性介在ニューロンのマーカーはこれらのサブグループ9-11の多くの具体的なCre媒介ドライバラインを生成するために使用されてきた。
MGE前駆細胞の移植は、不均衡によって引き起こされる障害を治療するための潜在的な細胞ベースの治療法として浮上している24 – 12を励起/阻害で。これらの治療効果は、多くの周囲の体阻害PV +細胞はMGEから誘導される（分化し、宿主脳に統合、分散させる）、または潜在的にのでMGE前駆体のユニークな能力に一部起因し得る。 MGE細胞はまた、遺伝的に、インビトロで改変された細胞は、in vivoで研究することを可能にする、迅速かつ効率的に移植する前に、15レンチウイルスで形質導入することができる。このアプローチを開発するための理論的根拠は、GABA作動性皮質介在ニューロンの発達と成熟を研究する中で障害物を克服することであった。変異マウスは、そうでなければ、早期の時点で死亡していたとき、特に、MGE移植は、研究者が、in vivoで変異細胞の発達を研究することができた。また、移植前に目的の遺伝子を導入することによって、変異体の表現型に特異的な遺伝子の効果はeffはで評価することができるicient方法。
ここでは、移植前にレンチウイルスMGE細胞を形質導入するための詳細なプロトコルを提供する。さらに、この技術はCre依存発現レンチウイルスおよび入手のCreドライバマウス系統の組み合わせを使用して、皮質介在ニューロン前駆体の異種グループから特定のニューロンのサブグループにおいて、目的の遺伝子を発現するように適合させることができるかを示す。遺伝的にユニークな方法でin vivo試験のためのGABA作動性皮質介在ニューロン前駆体を変更するにはまた、このプロトコルは、技術者や研究者のためのプラットフォームを導入しています。他の現在のアプローチに対するこの技術の1つの利点は、移植MGE細胞が離れて注射部位から分散することである。また、焦点のウイルス注射とは異なり、MGE細胞が分散した後、それらの形態は、評価することが容易です。このアプローチは、特定の細胞型を導入する、野生型または変異型の細胞に、目的とする遺伝子を導入することの効果を研究するために使用することができレポーター形態を評価するための、または潜在的にin vivoでの疾患対立遺伝子の効果を研究する。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞ベースの治療のための胚性神経節隆起（GES）からGABA作動性皮質介在ニューロンの前駆体の使用は、多くの条件12 -1 4のための約束を示している。正確な分子技術を追跡し、特定のニューロンのサブグループ内の対象の遺伝子を発現するために必要とされる。ここでは、移植前にレンチウイルス胚MGE細胞を標識するための詳細なプロトコルを提供し、この技術は、 インビボでの<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、からJLRRに助成金によってサポートされていました：自閉症は、ウェストンヘブンス財団、NIMH R01 MH081880、およびNIMH R37 MH049428、ニーナアイルランドを話す。 PRWは、台湾の国家科学委員会からのフェローシップによってサポートされていました。 SFSは、F32（MH103003）によってサポートされていました。
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
Referencias
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