Etiquetado y mediada por virus Trasplante de Medial ganglionar Eminencia (MGE) Las células para<em> En Vivo</em> Estudios
Summary
GABAérgicas progenitores interneuronas corticales se dispersan, desarrollar y sinápticamente integrar en una corteza de acogida después del trasplante. Estas células pueden ser fácilmente transducidas antes del trasplante para estudios in vivo de precursores GABAérgicas modificados genéticamente. Aquí, mostramos las técnicas de etiquetado virales para apuntar subgrupos interneuron específicos utilizando líneas de Cre existentes y reporteros Cre-dependientes.
Abstract
GABAérgicas interneuronas corticales, derivados de la medial embrionario y eminencias ganglionares caudales (MGE y CGE), son funcional y morfológicamente diversa. Las incursiones se han hecho en la comprensión de las funciones de los distintos subgrupos de interneuronas corticales, sin embargo, todavía hay muchos mecanismos por resolver que pueden contribuir al desarrollo y maduración de los diferentes tipos de células GABAérgicas. Por otra parte, la señalización GABAérgica alterado puede contribuir a fenotipos de autismo, la esquizofrenia y la epilepsia. Líneas específicas Cre-controladores han comenzado a repartir las funciones de subgrupos interneuron únicas. A pesar de los avances en modelos de ratón, a menudo es difícil de estudiar de manera eficiente GABAérgicas progenitores interneuronas corticales con enfoques moleculares in vivo. Una técnica importante utilizada para estudiar la programación autónoma celular de estas células es el trasplante de células MGE en cortezas de acogida. Estas células trasplantadas migrar considerablemente, diferenciar, unand integrar funcionalmente. Además, las células MGE pueden ser transducidas eficientemente con lentivirus inmediatamente antes del trasplante, lo que permite una multitud de enfoques moleculares. A continuación te detallamos un protocolo para transducir eficazmente células MGE antes del trasplante para el análisis in vivo, utilizando líneas de Cre-controladores disponibles y vectores de expresión Cre-dependientes. Este enfoque es ventajoso, ya que combina la manipulación genética precisa con la capacidad de estas células para dispersar después del trasplante, lo que permite una mayor resolución específica de tipo celular in vivo.
Introduction
GABAérgicas interneuronas corticales comprenden ~ 20-30% de las neuronas en la neocorteza de los mamíferos, mientras que el resto corresponde a excitatorios, neuronas glutamatérgicas principales. Las interneuronas son muy diversos en las propiedades electrofisiológicas, axón y dendritas y morfología sináptica objetivo 1, y los desequilibrios en el tono excitatorio / inhibitoria son la hipótesis de base de algunos fenotipos de los trastornos neuropsiquiátricos / neurológicos como el autismo, la esquizofrenia y la epilepsia 2. El objetivo general del protocolo descrito en este documento es proporcionar un medio para modificar genéticamente de manera eficiente GABAérgicas progenitores interneuronas corticales antes del trasplante para análisis in vivo.
Interneuronas corticales GABAérgicas nacen en las eminencias ganglionares medial y caudal (MGE y CGE, respectivamente) 3,4, así como el área preóptica 5. Progenitores interneuronas corticales se someten a larga distancia migración tangencial seguidopor la migración radial para llegar a sus objetivos finales. Al llegar a sus destinos, estas interneuronas corticales deben integrar correctamente en la red neuronal existente, y cada subgrupo interneuron única contribuirán a los circuitos corticales de maneras específicas. Cuatro subgrupos principales se pueden distinguir por marcadores moleculares: somatostatina derivados de MGE (SST) + y parvalbúmina (PV) + subgrupos, y péptido derivado de CGE vasoactivo intestinal (VIP) + y + Reelin; SST – 6 subgrupos. Diferentes subgrupos interneuronas corticales nacen en diferentes tiempos durante el desarrollo embrionario en el MGE y CGE 7, 8. Estos y otros marcadores de interneuronas GABAérgicas corticales se han utilizado para generar líneas Cre-controlador específico para muchos de estos subgrupos 9-11.
El trasplante de progenitores MGE ha surgido como una terapia basada en células potencial para el tratamiento de trastornos que pueden ser causados por desequilibriosen excitación / inhibición de 12 – 24. Estos beneficios terapéuticos pueden deberse en parte a la capacidad única de los progenitores MGE (a dispersarse, diferenciar e integrar en un cerebro huésped), o potencialmente debido a que muchos peri-somáticas células fotovoltaicas inhibidora + se derivan de la MGE. MGE células también pueden ser rápida y eficientemente transducidas con lentivirus antes del trasplante 15, permitiendo que las células que se modifican genéticamente in vitro para estudiar in vivo. La razón fundamental para el desarrollo de este enfoque era superar obstáculos en el estudio GABAérgica desarrollo interneuronas corticales y maduración. En particular, MGE trasplante permitió a los investigadores a estudiar el desarrollo de las células mutantes in vivo, cuando el ratón mutante tendría de otro modo muerto en un punto de tiempo temprano. Por otra parte, mediante la introducción de genes de interés antes del trasplante, los efectos de genes específicos en un fenotipo mutante podrían evaluarse en un effmanera ciente.
Aquí, ofrecemos un protocolo detallado para la transducción de células MGE con lentivirus previas al trasplante. Además, se muestra cómo esta técnica se puede adaptar para expresar un gen de interés en subgrupos específicos interneuronas de un grupo heterogéneo de precursores interneuronas corticales, utilizando una combinación de los lentivirus de expresión Cre-dependientes y disponibles líneas de ratones Cre-conductor. Por otra parte, este protocolo introduce técnicas y una plataforma para los investigadores de modificar genéticamente GABAérgicas precursores interneuronas corticales para estudios in vivo de una manera única. Una ventaja de esta técnica sobre otros enfoques actuales es que las células trasplantadas MGE se dispersarán lejos del sitio de la inyección. También, a diferencia de las inyecciones virales focales, después de las células MGE dispersan su morfología es más fácil de evaluar. Este enfoque se puede utilizar para estudiar el efecto de la introducción de genes de interés en las células de tipo salvaje o mutantes, la introducción de un tipo específico de célulareportero para evaluar la morfología, o potencialmente para estudiar el efecto de los alelos de la enfermedad in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de GABAérgicas precursores interneuronas corticales de las eminencias ganglionares embrionarias (GES) para las terapias celulares basadas está mostrando promesa para muchas condiciones 12 -1 4. Se necesitan técnicas moleculares precisas para realizar un seguimiento, y expresar genes de interés en subgrupos específicos interneuronas. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el etiquetado de las células embrionarias MGE con lentivirus antes del trasplante y mostrar cómo esta técnica puede…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Fundación, NIMH R01 MH081880, y NIMH R37 MH049428. PRW fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán. SFS fue apoyada por F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
Referencias
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