Rotulagem mediada por vírus e transplante de Medial ganglionar Eminence (MGE) Células para<em> In Vivo</em> Estudos
Summary
GABAergic progenitores Interneuron cortical dispersar, desenvolver e synaptically integrar em um córtex hospedeiro após o transplante. Estas células podem ser facilmente transduzidas antes do transplante para estudos in vivo de precursores GABAergic geneticamente modificados. Aqui, vamos mostrar técnicas de marcação virais alvo subgrupos Interneuron específicos usando linhas Cre existentes e repórteres Cre-dependentes.
Abstract
GABAergic interneurons corticais, derivados da medial embrionário e eminências ganglionares caudal (MGE e CGE), são funcionalmente e morfologicamente diverso. Incursões foram feitas na compreensão dos papéis dos diferentes subgrupos Interneuron corticais, no entanto, ainda existem muitos mecanismos a serem trabalhados que podem contribuir para o desenvolvimento e maturação de diferentes tipos de células GABAergic. Além disso, a sinalização GABAérgica alterada pode contribuir para fenótipos de autismo, esquizofrenia e epilepsia. Linhas Cre-driver específico começaram a dividir as funções de subgrupos Interneuron únicas. Apesar dos avanços em modelos de ratos, muitas vezes é difícil de estudar de forma eficiente GABAergic progenitores Interneuron cortical com abordagens moleculares in vivo. Uma técnica importante para estudar a programação autónoma celular destas células é o transplante de células MGE em córtexes hospedeiros. Estas células transplantadas migrar extensivamente, diferenciar, umand funcionalmente integrar. Além disso, as células podem ser eficientemente MGE transduzidas com lentivírus imediatamente antes do transplante, o que permite uma grande variedade de abordagens moleculares. Aqui nós detalhe de um protocolo para a transdução de forma eficiente as células MGE antes do transplante para análise in vivo, utilizando linhas de Cre-driver disponíveis e vectores de expressão Cre-dependentes. Esta abordagem é vantajosa porque combina manipulação genética precisa com a capacidade destas células para dispersar após o transplante, que permite uma maior resolução específica do tipo celular in vivo.
Introduction
GABAergic interneurons corticais compreendem ~ 20-30% dos neurônios no neocórtex de mamíferos, enquanto o restante corresponde a excitatórios, neurônios principais glutamatérgicos. Interneurons são altamente diversificada em propriedades eletrofisiológicas, axônio e dendritos e morfologia sináptica alvo 1, e os desequilíbrios em tom excitatório / inibitória são hipoteticamente subjacentes alguns fenótipos de distúrbios neurológicos / neuropsiquiátricos, incluindo autismo, esquizofrenia e epilepsia 2. O objetivo geral do protocolo aqui descrito é o de proporcionar um meio para modificar de forma eficiente geneticamente GABAergic progenitores Interneuron corticais antes do transplante para análise in vivo.
Interneurons Cortical GABAergic nascem nas eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE, respectivamente) 3,4, bem como a área pré-óptica 5. Progenitores Interneuron corticais submetidos a migração tangencial de longa distância seguidopela migração radial para alcançar os seus objectivos finais. Após a chegada ao seu destino, estes interneurônios corticais deve integrar corretamente na rede neuronal existente, e cada subgrupo interneuron única contribuirá para circuitos cortical de maneiras específicas. Quatro subgrupos principais podem ser distinguidos por meio de marcadores moleculares: MGE-derivado de somatostatina (SST) + e parvalbumina (PV) + subgrupos, e peptídeo derivado CGE-intestinal vasoactivo (VIP) e Reelin + +; – SST 6 subgrupos. Diferentes subgrupos Interneuron corticais nascem ao longo de diferentes tempos durante o desenvolvimento embrionário na CGE MGE e 7, 8. Estes e outros marcadores Interneuron GABAérgicos corticais foram usadas para gerar linhas de Cre-controlador específico para muitos destes subgrupos 9-11.
O transplante de células progenitoras MGE emergiu como uma terapia baseada em células potencial para doenças que podem ser causadas por desequilíbrios tratarem excitação / inibição 12-24. Estes benefícios terapêuticos pode ser devido, em parte, à capacidade única de progenitores MGE (para dispersar, diferenciar e integrar um cérebro hospedeiro), ou potencialmente porque muitos peri-somáticas PV inibidora + células são derivadas do MGE. MGE células também podem ser rapidamente e eficientemente transduzidas com lentivírus antes do transplante 15, permitindo que as células que são geneticamente modificadas in vitro para ser estudada in vivo. A justificativa para o desenvolvimento desta abordagem foi a de superar obstáculos em estudar GABAergic desenvolvimento interneuron cortical e maturação. Em particular, o transplante MGE permitiu aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento de células mutantes in vivo, quando o rato mutante forma teriam morrido em um ponto de tempo inicial. Além disso, através da introdução de genes de interesse antes do transplante, os efeitos de genes específicos em um fenótipo mutante pode ser avaliado em um efforma icient.
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para transdução de células MGE com lentivírus antes do transplante. Além disso, mostramos como essa técnica pode ser adaptada para expressar um gene de interesse em subgrupos específicos Interneuron a partir de um grupo heterogêneo de precursores Interneuron corticais, usando uma combinação de lentivírus de expressão Cre-dependentes e disponíveis linhas de rato Cre-driver. Além disso, este protocolo introduz técnicas e uma plataforma para pesquisadores para modificar geneticamente GABAergic precursores Interneuron cortical para estudos in vivo de uma forma única. Uma vantagem desta técnica em relação a outros métodos correntes é que as células transplantadas MGE irá dispersar longe do local de injecção. Além disso, ao contrário de injecções virais focais, depois que as células MGE dispersar sua morfologia é mais fácil de avaliar. Esta abordagem pode ser utilizada para estudar o efeito da introdução de genes de interesse em células de tipo selvagem ou mutantes, a introdução de um tipo de célula específicorepórter para avaliar a morfologia, ou, potencialmente, para estudar o efeito dos alelos da doença in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de GABAergic precursores Interneuron cortical das eminências ganglionares embrionárias (BEE) para terapias à base de células está mostrando a promessa para muitas condições 12 -1 4. São necessárias técnicas moleculares precisos para acompanhar e expressar genes de interesse em subgrupos Interneuron específicos. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a marcação das células embrionárias com lentivírus MGE antes do transplante e mostrar como esta técnica pode ser utilizada para e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações para JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 e NIMH R37 MH049428. PRW foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan. SFS foi apoiada por F32 (MH103003).
Materials
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 301/2 gauge needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | n.a. | made in house | |
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | n.a. | Any drug store or pharmacy | |
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
Referencias
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