Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren
Summary
To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Abstract
Die Leber hat eine große Kapazität zu regenerieren. Hepatocyte- oder Gallengetriebenen Leberregeneration: Hepatozyten, die parenchymale Zellen der Leber, in eine von zwei Arten zu regenerieren. In Hepatocyten getriebenen Leberregeneration, regenerieren Hepatozyten aus vorbestehenden Hepatozyten abgeleitet ist, während, in der Gallengetriebenen Regeneration werden Regenerieren von Hepatozyten und Gallen Epithelzellen (BECs) abgeleitet. Für Hepatozyten getriebenen Leberregeneration, gibt es sehr gute Nagermodellen, die wesentlich zum aktuellen Verständnis der Leberregeneration beigetragen haben. Es besteht jedoch keine solche Nagetiermodell für Gallengetriebenen Leberregeneration. Wir haben vor kurzem auf einem Zebrafischleberschäden Modell, in dem BECs weitgehend Anlass zu Hepatozyten bei schweren Hepatozyten-Verlust geben wiesen. In diesem Modell werden die Leberzellen spezifisch durch eine pharmakogenetische Mittel abgetragen. Hier im Detail präsentieren wir die Methoden, um Hepatozyten abzutragen und den BEC-driven Leberregenerationsprozess zu analysieren.Diese Hepatozyten-spezifische Ablation Modell kann weiter verwendet werden, um die zugrunde liegenden molekularen und zellulären Mechanismen der Gallengetriebenen Leberregeneration entdecken werden. Darüber hinaus können diese Verfahren, um chemische Bildschirmen angewendet werden, um kleine Moleküle, erweitern oder die Regeneration der Leber zu unterdrücken identifizieren.
Introduction
Die Leber ist ein hoch regenerative Organ. Während der Leberregeneration, Regeneration von Leberzellen, die parenchymale Zellen der Leber, sind aus vorbestehenden Leberzellen (Hepatozyten getriebenen Leberregeneration) oder BECs (Gallengetriebenen Leberregeneration) 1,2 abgeleitet. Leberschäden hervorruft, in der Regel die Verbreitung von bereits bestehenden Leberzellen; Wenn jedoch Hepatozytenproliferation kompromittiert ist, kann dazu beitragen, BECs Hepatozyten 2-4. Diese beiden Modi der Leberregeneration klinisch signifikant. Nach der operativen Entfernung eines Teils der menschlichen Leber (zB aufgrund von Lebertumoren oder lebenden Leberspender), Hepatozyten im Leberrest vermehren, um die verlorene Lebermasse wiederherzustellen. Dagegen bei Patienten mit schweren Lebererkrankungen, Hepatozytenproliferation stark beeinträchtigt wird, so daß BECs oder Leberstammzellen (LPCs) scheinen zur Regenerierung Hepatozyten 5,6 beizutragen. Das Nagetier 2/3 Teilhepatektomie Modell, in demHepatozyten vermehren, um die Lebermasse verloren zu erholen, hat wesentlich zum derzeitigen Verständnis der Hepatozyten-driven Leberregeneration 7,8 beigetragen. Jedoch gibt es keine gültige Nagetiermodell, in dem Regenerieren Hepatozyten werden hauptsächlich aus BECs abgeleitet. Obwohl mehrere Nagetier Lebertoxin Modellen führte zur Identifizierung von Gallengetriebenen Leberregeneration 2-4, letzten Linienverfolgungsstudien an Mäusen zeigen einen minimalen Beitrag von BECs regenerierendes Leberzellen in diesen Modellen 9,10. Einige der Nagetiermodellen Leberverletzung, einschließlich partieller Hepatektomie 11-13 und Acetaminophen induzierten Leberschaden 14,15 haben Zebrafisch angewandt und führten zur Identifizierung neuer Gene oder Wege bei der Leberregeneration in Verbindung gebracht. Allerdings Hepatozyten-getrieben, aber nicht BEC-getrieben, tritt die Leberregeneration in diesen Zebrafischleberschäden Modelle. Daher ist eine neuartige Leberschäden Modell, in dem BECs weitgehend an Regenerat beitragening Hepatozyten ist für ein besseres Verständnis der BEC getriebenen Leberregeneration benötigt.
Die übergeordneten Ziele des Hepatozyten-Ablation Modell hier beschrieben sind (1), um eine Schädigung der Leber Modell, in dem BECs weitgehend zu regenerierenden Leberzellen beitragen, und (2) Aufklärung der molekularen und zellulären Mechanismen BEC-driven Leberregeneration zugrunde zu generieren. Wir vermuten, dass die Schwere der Verletzung bestimmt den Modus der Leberregeneration; So sagten wir voraus, dass Gallengetriebenen Leberregeneration würde von schweren Verletzungen Hepatozyten zu initiieren. Um diese Hypothese zu testen, ein Zebrafischleberschäden Modell entwickelten wir durch die Erzeugung eines transgenen Linie, Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931, dass hoch drückt bakterielle Nitroreduktase (NTR) mit cyan fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert unter der Hepatozyten-spezifischen fabp10a Promotor. Da NTR wandelt das nicht-toxische Prodrug, Metronidazol (MTZ), in ein zytotoxisches Arzneimittel, abträgt es nur die beabsichtigte NTR-exprimierenden Zellen 16-18, in diesem Fall werden die Hepatozyten. Durch Manipulation der Dauer der MTZ Behandlung kann das Ausmaß der Ablation Hepatozyten gesteuert werden. Mit diesem Modell haben wir vor kurzem berichtet, dass bei schweren Hepatozyten Verlust, BECs weitgehend Anlass zu regenerierenden Leberzellen 19, die durch zwei weitere unabhängige Studien 20,21 bestätigt wurde. Daher kann im Vergleich zu dem vorgenannten Nagetier und Zebrafisch Leberverletzung Modellen ist unsere Hepatozyten Ablation Modell zum Studium BEC getriebenen Leberregeneration vorteilhafter.
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren für die Durchführung der Leberregeneration Experimente unter Verwendung der Zebrafisch-Hepatozyten-Ablation-Modell. Dieses Modell wird für die Ermittlung der Mechanismen Gallengetriebenen Leberregeneration zugrunde liegenden und für die chemische Bildschirme, um kleine Moleküle, die zu unterdrücken oder zu erweitern Leberregeneration identifizieren können geeignet sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ernst, aber nicht mild, entlockt Hepatozyten-Ablation Gallengetriebenen Leberregeneration. Daher wird nach Mtz Behandlung und Auswaschen, ist es wichtig, um die Leber Größe des MTZ-behandelten Larven, die durch intrinsische Fluoreszenz des GFP fabp10a bewertet werden können untersuchen: GFP-Transgen NTR. Da ein kleiner Prozentsatz der MTZ-behandelten Larven wird nicht abgetragenen (0-5%) oder (10-20%) Lebern teilweise abgetragen anzuzeigen, ist es wichtig zu klären, und nur analysieren die Larven m…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
Materials
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
Referencias
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