To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
O fígado tem uma grande capacidade para se regenerar. Os hepatócitos, as células parenquimatosas do fígado, pode regenerar em uma de duas maneiras: a regeneração hepática hepatocyte- ou accionada por biliar. Na regeneração hepática-driven hepatócitos, os hepatócitos em regeneração são derivados de hepatócitos pré-existentes, ao passo que, na regeneração-driven biliar, hepatócitos em regeneração são derivadas de células epiteliais das vias biliares (CEBs). Para a regeneração hepática-driven hepatócito, existem modelos de roedores excelentes que têm contribuído significativamente para a compreensão atual da regeneração hepática. No entanto, não existe tal modelo de roedor existe para regeneração hepática-driven biliar. Nós recentemente relatado em um modelo de fígado de peixe-zebra em que BECs extensivamente dar origem a hepatócitos após a perda de hepatócitos grave. Neste modelo, os hepatócitos são especificamente ablação por um meio de farmacogenética. Aqui nós apresentamos em detalhes os métodos para retirar hepatócitos e analisar o processo de regeneração hepática BEC-driven.Este modelo de ablação específica do hepatócito pode ser ainda usado para descobrir os mecanismos moleculares e celulares subjacentes da regeneração hepática-driven biliar. Além disso, estes métodos podem ser aplicados para telas químicas para identificar moléculas pequenas que aumentam ou suprimem a regeneração do fígado.
O fígado é um órgão altamente regenerativa. Durante a regeneração do fígado, regenerar hepatócitos, as células do parênquima do fígado, são derivados de hepatócitos pré-existentes (regeneração hepática-driven hepatócitos) ou BEC (regeneração hepática-driven biliar) 1,2. A lesão hepática geralmente provoca a proliferação de hepatócitos pré-existentes; no entanto, quando a proliferação de hepatócitos é comprometida, CEBs pode contribuir para hepatócitos 2-4. Estes dois modos de regeneração do fígado são clinicamente significativa. Após a remoção cirúrgica de uma porção do fígado humano (por exemplo, devido a tumores do fígado ou dadores vivos de fígado), hepatócitos no fígado proliferam restante para recuperar a massa do fígado perdida. Em contraste, em doentes com doenças hepáticas graves, a proliferação dos hepatócitos é grandemente comprometida, de modo a que as CEBs ou células progenitoras do fígado (LPCs) parecem contribuir para a regeneração de hepatócitos 5,6. O modelo de roedor 2/3 hepatectomia parcial, em quehepatócitos proliferam para recuperar a massa hepática perdido, tem contribuído significativamente para a compreensão atual de-driven hepatócito regeneração hepática 7,8. No entanto, não existe um modelo roedor válido no qual os hepatócitos em regeneração são derivados principalmente de CEBs. Embora vários modelos de toxina de roedor fígado levou à identificação de-driven biliar regeneração hepática 2-4, estudos recentes em rastreio de linhagem ratos indicam uma contribuição mínima de CEBs para regenerar hepatócitos nestes modelos 9,10. Alguns dos modelos de lesão de fígado de roedores, incluindo hepatectomia parcial 11-13 e induzida por acetaminofeno danos no fígado 14,15, ter sido aplicada a peixes-zebra e levou à identificação de novos genes ou vias envolvidas na regeneração do fígado. No entanto, hepatócito-driven, mas não BEC-driven, a regeneração do fígado ocorre nesses modelos de lesão do fígado de peixe-zebra. Portanto, um modelo de fígado romance em que BECs contribuir amplamente para se regeneraing hepatócitos é necessária para uma melhor compreensão da regeneração hepática BEC-driven.
Os objetivos gerais do modelo de ablação de hepatócitos descritos aqui são (1) para gerar um modelo de fígado em que BECs contribuir amplamente para os hepatócitos em regeneração, e (2) elucidar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes regeneração hepática BEC-driven. Nossa hipótese é que a gravidade da lesão determina o modo de regeneração do fígado; Assim, previmos que a regeneração hepática-driven biliar iniciaria após lesão hepática grave. Para testar esta hipótese, desenvolvemos um modelo de fígado de peixe-zebra, gerando uma linhagem transgênica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, que é altamente expressa nitrorredutase bacteriana (NTR) fundido com a proteína fluorescente ciano (PCP), sob a fabp10a específicas do hepatócito promotor. Desde NTR converte a pró-droga não tóxica, metronidazol (Mtz), em um fármaco citotóxico, ele destina-se somente a ablates NTR-células que expressam 16-18, neste caso, os hepatócitos. Ao manipular a duração do tratamento Mtz, a extensão da ablação de hepatócitos pode ser controlada. Usando esse modelo, que recentemente informou que após a perda de hepatócitos grave, BECs extensivamente dar origem a regeneração hepatócitos 19, que foi ainda confirmada por outros dois estudos independentes 20,21. Portanto, em comparação com o acima mencionado roedor e modelos de lesão de fígado de peixe-zebra, o nosso modelo de ablação dos hepatócitos é mais vantajoso para estudar a regeneração hepática BEC-dirigido.
Este protocolo descreve o procedimento para a realização de experimentos de regeneração hepática utilizando o modelo de ablação de hepatócitos peixe-zebra. Este modelo será adequado para determinar os mecanismos subjacentes a regeneração hepática-driven biliar e para telas químicas para identificar pequenas moléculas que pode reprimir ou aumentam a regeneração do fígado.
Grave, mas não leve, ablação de hepatócitos provoca a regeneração do fígado-driven biliar. Por conseguinte, após o tratamento de lavagem e Mtz, é importante para examinar o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz, que pode ser avaliada pela fluorescência intrínseca do PCP fabp10a: NTR-PCP transgene. Uma vez que uma pequena percentagem das larvas tratadas com Mtz exibirá não excisada (0-5%) ou parcialmente ablação (10-20%) os fígados, é essencial para resolver e apenas analisar as larvas …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |