Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Summary

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Abstract

Celinkapselende werd ontwikkeld om levende cellen te vangen binnen semi-permeabele membranen. De geënte ingekapselde cellen kunnen laagmoleculaire metabolieten wisselen in weefsels van de behandelde gastheer voor overleving op lange termijn realiseren. Het halfdoorlaatbare membraan maakt geënt ingekapselde cellen om afstoting te voorkomen door het immuunsysteem. De inkapselingsprocedure is ontworpen om een ​​gecontroleerde afgifte van bioactieve stoffen, zoals insuline, andere hormonen en cytokinen mogelijk. Hier beschrijven we een werkwijze voor het inkapselen van katabole cellen, welke lipiden om warmte en energiedissipatie (thermogenese) in de intra-abdominale vetweefsel van obese muizen verbruikt. Inkapseling van thermogene katabole cellen kunnen eventueel van toepassing zijn op de preventie en behandeling van obesitas en type 2 diabetes. Een andere mogelijke toepassing van katabole cellen kunnen detoxificatie van alcoholen of andere toxische metabolieten en milieuverontreinigende stoffen.

Introduction

Toenemend aantal chronische ziekten ¹ heeft studies gestimuleerde op transplantatie van de therapeutische celpopulaties ^2. Syngene of allogene stamcellen zijn de meest gebruikte celtypen voor deze toepassingen ^2. Echter, deze behandelingen geen controle van differentiatie en migratie van stamcellen na implantatie mogelijk te maken en zijn niet kostenefficiënt. Transplantatie van genetisch gemodificeerde cellen met voordelige functies anticipeert verbeteren van de behandeling van vele ziekten. Echter, genetische modificaties cel herkend door het immuunsysteem van de gastheer derhalve deze behandelingen vereisen immunosuppressie ^3. Het inkapselen van cellen die insuline is ontwikkeld door Dr. Chang ^4. De techniek is gebaseerd op het inkapselen van cellen in alginaat druppels die worden ondergedompeld in een calciumchlorideoplossing. Alginaat moleculen omvatten mannuronzuur (M) en guluronzuur (G) en kunnen worden verbonden door Ca ²⁺. Na gelering worden de korrels gesuspendeerd a poly-L-lysine (PLL) oplossing. Tijdens deze stap, PLL bindt aan G en M in het alginaat moleculen die het membraan van de capsule vaststelt. De porositeit van het membraan van de capsule kan worden gemoduleerd door het variëren van de M en PLL concentraties, de incubatietijd en temperatuur. De binding van de PLL ook afhankelijk van de soort en concentratie van alginaat. Alginaat matrices verknoopt met Ca2 ⁺ -ionen zijn instabiel bij fysiologische omgeving of gemeen bufferoplossingen met een hoge concentratie fosfaat en citraat-ionen. Deze buffers kunnen halen Ca ²⁺ van het alginaat en vloeibaar te maken de kern. Vloeibaar maken van het alginaat kern biedt ruimte binnen de capsules voor cellulaire beweging en groei. Cellen ingekapseld in polyanionische alginaat met polykation poly-L-lysine (APL) impermeabel voor immunoglobulinen maar instroom van nutriënten en efflux van toxines. Deze eigenschappen APL's mogelijk te maken op de lange termijn survival van ingekapselde cellen na transplantatie in genetisch verschillende hosts. Elliott et al. Beschreven de overleving functioneren ingekapselde varkens pancreas cellen in een menselijke patiënt negen jaar na implantatie ^5.

Inkapseling technieken kunnen worden ingedeeld in microinkapseling (3-800 urn) en macro-inkapseling (groter dan 1000 urn). Microcapsules zijn duurzamer dan macrocapsules ^6. Sinds de ontdekking door Dr. Chang en collega's in 1964, is mikroinkapseling wijd gebruikt voor het inkapselen van anabole cellen produceren insuline, andere hormonen, en bioactieve moleculen ^7. Deze behandelingen geconfronteerd met verschillende uitdagingen in de gastheerweefsel inclusief fibrose en immuunrespons ^8. Aanvankelijk zijn de bijwerkingen die verband houden met de kwaliteit van biopolymeren opgelost. Echter, transplantatie van anabole cellen initieert steeds neveneffecten, zoals fibrose ten gevolge van hormonale overproductie buiten een gespecialiseerde klier.

In de afgelopen decennia, obesitas en type 2 diabetes heeft epidemische proporties ⁹ bereikt. Meer dan 30% van de volwassen mensen wereldwijd zijn overgewicht en obesitas ^10. Toegenomen intra-abdominale (IAB) vetvorming verhoogt incidentie van chronische ontsteking en bevordert Type 2 diabetes, hart- en vaatziekten, bepaalde vormen van kanker en andere morbidities ^11-13. Verschillende lijnen van bewijs suggereerde dat pathogenese geassocieerd met IAB vet kan worden afgewend door specifieke adipocyten. Recente studies hebben aangetoond dat transplantatie van subcutane adipocyten in IAB gebied kan verbeteren metabolisme en obesitas en insulineresistentie afname van knaagdieren in vivo ^14. Effectieve vermindering van obesitas en insuline resistentie is geassocieerd met thermogene adipocyten energie kunnen absorberen in de vorm van warmte ^15,16. Thermogene modificatie van adipocyten kan worden bereikt door stabiele transfectiegenen die deelnemen aan de mitochondriële ontkoppeling proton, zoals ontkoppelingseiwit 1 (UCP1) of genen die expressie van UCP1 en andere thermogene genen ^15,16. Onze recente studies aangetoond dat tekort aan aldehyde dehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) tot een thermogene verbouwing van lab vet dat obesitas en insulineresistentie vermindert in deze muizen ^17,18. Met name, inkapseling van thermogene Aldh1a1 deficiënte (Aldh1a1 – / -) preadipocytes medieert hetzelfde therapeutisch effect bij IAB vet in obese wildtype muizen, wat suggereert nieuwe therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van lab vet ^18. In experimentele instellingen ingekapselde cellen kunnen de onderzoekers effecten van specifieke celpopulaties te bestuderen op een kosteneffectieve wijze ^19. Hier bespreken we de methode van inkapseling van een thermogene katabole cellijn en zijn laboratorium en therapeutische toepassing in een muismodel van obesitas. Het protocol beschrijft trie fasen microcapsule productie (Figuur 1): de vorming van het alginaat microkorrels (figuur 1A), de vorming van polykation poly-L-lysine (PLL) membraan op het oppervlak van de microbolletjes (figuur 1B), en het verwijderen van de alginaat kernen (figuur 1C).

Protocol

Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Ohio State University ethische commissies. Dierproeven werden goedgekeurd door IACUC protocol. Alle procedures werden uitgevoerd onder het niveau 2 bioveiligheid kast met laminaire stroming. We volgden alle standaard veiligheidseisen en procedures. De micro-inkapseling techniek voor bereiding van microcapsules werd uitgevoerd zoals beschreven 17, 18. 1. Voorbereidingen van Materialen Maak 10 ml van 2% natriumalginaat-oplossing…

Representative Results

Figuur 1 laat zien dat elke stap van microbeads productie onder de microscoop kan worden gecontroleerd. Figuur 2A laat zien hoe co-cultuur adipocyten met een monolaag van ingekapselde cellen. Figuur 2B is een representatief voorbeeld van een kwantitatief onderzoek met adipocyte / microcapsules co-culturen die werden in hoofdstuk 5. Lysaten beschreven van adipocyten werden geanalyseerd met behulp van Western blot. Ingekapselde cellen werden niet geanalyseerd in dit exper…

Discussion

Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om cellen, met inbegrip van drogen, extrusie en emulsie ¹⁹ te kapselen. In deze werkwijze worden de alginaatparels geëxtrudeerd door een naald, vervolgens met PLL en het alginaat kern wordt ontbonden de inkapseling te voltooien. Hoewel deze methode is gebruikt voor jaren, de vorming van de bolletjes met de gewenste grootte en bolvorm blijft een uitdaging. De grootte van de capsules is sterk afhankelijk van de viscositeit van natriumalginaat-oplossing, de extruder diamet…

Materials

Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	None
KD scientific syringe pump	KD scientific	780100Y	None
Olympus microscope	Olympus Optical	IX70-S8F2	None
Sodium alginate	Sigma	MKBP8122V	None
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	None
Calcium chloride	Sigma	SLBJ2662V	None
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	None
Sodium chloride	Sigma	SLBD2595V	None
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	None
ATGL primary antibody (from rabbit)	Cell Signaling	2138S	None
Secondary anti body (anti rabbit)	LI-COR	926-68071	None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	None
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsin	Gibco	25200-056	None
Cortizone 10 anti-itch ointment	Cortizone 10	C4029138	None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	None
Newborn calf serum (CS)	Sigma	N4762	None
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F4135	None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	None
Dexamethasone	Sigma	D4902	None
Insulin (bovine)	Sigma	I5879	None
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693159001	None