Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux
Summary
Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.
Abstract
Cellule encapsulation est développé pour piéger des cellules viables dans des membranes semi-perméables. Les cellules encapsulées greffées peuvent échanger des metabolites de faible poids moléculaire dans les tissus de l'hôte traité pour obtenir une survie à long terme. La membrane semi-perméable permet greffé cellules encapsulées pour éviter le rejet par le système immunitaire. Le procédé d'encapsulation a été conçu pour permettre une libération contrôlée de composés bioactifs, tels que l'insuline, des hormones et d'autres cytokines. Nous décrivons ici un procédé pour l'encapsulation de cellules cataboliques, qui consomment des lipides pour la production de chaleur et de dissipation d'énergie (thermogenèse) dans le tissu adipeux intra-abdominale de souris obèses. Encapsulation de cellules cataboliques thermogénique peut être potentiellement applicable à la prévention et au traitement de l'obésité et le diabète de type 2. Une autre application potentielle de cellules cataboliques peut inclure la désintoxication d'alcools ou d'autres métabolites toxiques et des polluants environnementaux.
Introduction
L'incidence croissante des maladies chroniques 1 a stimulé les études sur la transplantation de populations de cellules thérapeutiques 2. Cellules souches syngéniques ou allogéniques sont les types de cellules les plus couramment utilisés pour ces applications 2. Cependant, ces traitements ne permettent pas le contrôle de la différenciation et la migration de cellules souches après l'implantation et ne sont pas économiques efficace. La transplantation de cellules génétiquement modifiées avec les fonctions bénéfiques prévoit améliorer le traitement de nombreuses maladies. Cependant, les modifications génétiques de cellules sont reconnus par le système immunitaire de l'hôte, par conséquent, ces traitements nécessitent trois immunosuppression. L'encapsulation de cellules produisant de l'insuline a été développé par le Dr Chang 4. La technique est basée sur l'encapsulation des cellules dans des gouttelettes d'alginate qui sont immergés dans une solution de chlorure de calcium. Les molécules d'alginate sont constitués d'acide mannuronique (M) et guluronique (G) et peuvent être connectés par Ca 2+. Après la gélification, les billes sont mises en suspension une poly-L-lysine (PLL) solution. Au cours de cette étape, PLL se lie à G et M dans les molécules d'alginate qui établit la membrane de la capsule. La porosité de la membrane de la capsule peut être modulée en faisant varier les concentrations de S PLL, et le temps d'incubation et de la température. La liaison de PLL dépend aussi du type et de la concentration d'alginate. Des matrices d'alginate réticulé par des ions Ca 2+, sont instables dans le milieu physiologique ou dans des solutions tampons à forte concentration communs de phosphate et les ions citrate. Ces tampons peuvent extraire Ca 2+ de l'alginate et liquéfier le noyau. La liquéfaction du noyau alginate offre un espace à l'intérieur des capsules pour le mouvement cellulaire et la croissance. Les cellules encapsulées dans de l'alginate polyanionique avec polycationique poly-L-lysine (APL) sont imperméables pour des immunoglobulines mais ont afflux d'éléments nutritifs et l'efflux de toxines. Les propriétés de ceux-ci APL permettent long terme survival des cellules encapsulées après transplantation dans génétiquement différents hôtes. Elliott et al. A rapporté la survie de fonctionnement des cellules du pancréas de porc encapsulés dans un patient humain neuf ans après l'implantation 5.
techniques d'encapsulation peuvent être classés en microencapsulation (3-800 um) et macroencapsulation (supérieure à 1000 um). Microcapsules sont plus durables que macrocapsules 6. Depuis sa découverte par le Dr Chang et ses collègues en 1964, microencapsulation a été largement utilisé pour l'encapsulation de cellules produisant l'insuline anabolisants, hormones et autres molécules bioactives 7. Ces traitements confrontés à plusieurs défis dans le tissu hôte, y compris la fibrose et la réponse immunitaire 8. Dans un premier temps, les effets secondaires liés à la qualité de biopolymères ont été résolus. Cependant, la transplantation de cellules anabolisants déclenche toujours des effets secondaires, tels que la fibrose, à la suite de l'hormone overproduction à l'extérieur d'une glande spécialisé.
Au cours des dernières décennies, l'obésité et le diabète de type 2 a atteint des proportions épidémiques 9. Plus de 30% des personnes adultes dans le monde sont en surpoids et obèses 10. Intra-abdominale (IAB) formation accrue de graisse augmente l'incidence de l'inflammation chronique et favorise le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires, de certains cancers et d'autres pathologies 11-13. Plusieurs éléments de preuve suggèrent que la pathogenèse associée avec de la graisse IAB peut être évitée par les adipocytes spécifiques. Des études récentes ont montré que la transplantation d'adipocytes sous-cutanés dans la région IAB peut améliorer le métabolisme et diminuer la résistance de l'obésité et de l'insuline chez les rongeurs in vivo 14. Une réduction efficace de la résistance de l'obésité et de l'insuline a été associé à adipocytes thermogénique capables de dissiper l'énergie sous forme de chaleur de 15,16. Modification thermogénique des adipocytes peut être obtenue par transfection stabledes gènes participant à la désolidarisation de protons mitochondrial, comme la protéine de découplage 1 (Ucp1) ou de gènes régulant l'expression de gènes et d'autres Ucp1 thermogénique 15,16. Nos études récentes ont montré que la déficience en aldéhyde déshydrogénase 1 a1 (aldh1a1) conduit à la rénovation de Iab graisse thermogénique qui réduit l'obésité et la résistance à l'insuline chez ces souris 17,18. Notamment, l'encapsulation des thermogénique aldh1a1 déficient (aldh1a1 – / -) préadipocytes médiatise même effet thérapeutique dans IAB graisse chez les souris de type sauvage obèses, ce qui suggère de nouvelles possibilités thérapeutiques pour le traitement de l'IAB graisses 18. Dans les paramètres expérimentaux, des cellules encapsulées permettent aux chercheurs d'étudier les effets des populations de cellules spécifiques dans une manière rentable 19. Ici, nous discutons du procédé d'encapsulation d'une lignée cellulaire catabolique thermogénique et son laboratoire et l'application thérapeutique dans un modèle de souris de l'obésité. Le protocole décrit tphases ROIS pour la production de microcapsules (figure 1): la formation des microbilles d'alginate (Figure 1A), la formation de la polycationique poly-L-lysine (PLL) de membranes à la surface des microbilles (figure 1B), et l'enlèvement de la alginate noyaux (Figure 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Diverses méthodes ont été utilisées pour encapsuler des cellules, y compris le séchage, l'extrusion, et 19 l'émulsion. Dans ce procédé, les billes d'alginate sont extrudes à travers une aiguille, puis revêtue d'PLL et le noyau alginate sera dissoute pour terminer l'encapsulation. Bien que cette méthode a été utilisée pendant des années, la formation des perles avec la taille désirée et forme sphérique est toujours difficile. La taille des capsules est fortement dépendant…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Jennifer Petrosino et David DiSilvestro de l'aide éditoriale. Cette recherche a été soutenue par numéro 20020728 Prix de l'American Egg Board et le numéro 10040042 Prix de Novo Nordisk Pharmaceuticals ainsi que par le Centre Innovation Alimentaire, Bureau des affaires internationales, Centre for Advanced Functional Foods de recherche, et de l'entrepreneuriat à l'OSU ainsi que la National Science Foundation accorde CEE-0914790 (LJL). Le projet décrit a été soutenue par le Prix Nombre R21OD017244 (OZ) et UL1RR025755 (OSUCCC) du National Center for Research Resources, financé par le Bureau du Directeur de la National Institutes of Health (OD) et soutenu par le NIH Roadmap for Medical Research et NCI P30CA16058. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Center for Research Resources ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
| KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
| Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
| Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
| Poly-l-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
| Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
| Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
| ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
| Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
| Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
| Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
| Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
| Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |
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