Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

Summary

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Abstract

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.

Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

Introduction

As doenças vasculares, tais como vasospasmo cerebral ^{1,2, 3} hipertensão, aterosclerose e ^4, desenvolvem-se lentamente, são tipicamente de natureza crónica, e envolvem disfuncional força de geração de células do músculo liso vascular (VSMCs). Nosso objetivo é estudar essas disfunções vasculares em progressão lenta utilizando métodos in vitro com um controle mais preciso de condições experimentais do que em modelos in vivo. Nós já desenvolvidas películas finas musculares vasculares (vMTFs) para a medição da contractilidade funcional de engenharia de tecidos in vitro cardiovasculares ^5, mas este método tem sido limitada a estudos relativamente curto. Aqui, nós apresentamos uma técnica de modificação substrato que se expande a nossa técnica anterior vMTF para medições de longo prazo.

Enquanto o endotélio é também crítico na função vascular no geral, lamelas arterial projetado fornecer um sistema modelo útil para avaliar alterações na vascularcontractilidade durante a progressão da doença. Para manipular um modelo de tecido de doença vascular funcional, tanto a estrutura e função da lamela arterial, a unidade de base contrátil do recipiente, deve ser reproduzido com alta fidelidade. Arterial lamelas são concêntricos folhas, circunferencialmente alinhadas de VSMCs de contrácteis separadas por folhas de elastina ^6. Microcontact impressão de matriz extracelular (ECM) proteínas sobre substratos de polidimetilsiloxano (PDMS) foi anteriormente utilizada para fornecer sinais de orientação para a organização do tecido para imitar alinhados tecido cardiovascular ^5,7-10. No entanto, tecidos estampados com impressão microcontact pode perder a integridade após 3-4 dias em cultura, o que limita a sua aplicabilidade em estudos crônicos. Este protocolo fornece uma solução para este problema, substituindo técnicas de impressão microcontact anteriores com uma nova técnica de deposição de microfluidos.

Genbutsu et al. PDMS substratos modificados com genipina e found viabilidade de miócitos prolongada até um mês na cultura ^11. Aqui, usamos uma abordagem semelhante para estender a cultura de células de músculo liso vascular estampados em PDMS. Genipina, um derivado hidrolítica natural da fruta gardénia, é um candidato desejável para modificação do substrato, devido à sua toxicidade relativamente baixa em comparação com agentes de reticulação similares e a sua crescente utilização como biomaterial nos domínios da reparação de tecidos e modificação ^12,13 ECM ^{14, 15.} Neste protocolo, a fibronectina é utilizada como um sinal de orientação de células, tal como nos processos anteriores de impressão microcontacto; no entanto, genipina é depositada sobre substratos de PDMS antes da fibronectina padronização. Assim, como as células degradam a matriz modelado, ECM recém-sintetizados a partir de VSMCs de anexados podem ligar-se ao substrato revestido PDMS-genipina.

Este protocolo utiliza um dispositivo de fornecimento de microfluidos de genipina de duas etapas e de deposição de ECM. O design do dispositivo microfluídico imita micromedidorpadrões de impressão ntact utilizados para lamelas arterial engenharia em estudos anteriores ^16. Assim, esperamos que este protocolo para produzir imita lamelas arterial que recapitulam o sucesso altamente alinhado na estrutura vivo e função contrátil de lamelas arterial. Nós também avaliar a contratilidade tecido para confirmar que genipina é um composto modificação substrato adequado para longo prazo em modelos de doenças vasculares in vitro.

Protocol

Nota: O objectivo deste protocolo é de construir e utilizar um filme fino vascular muscular (vMTF) com a estrutura mostrada na Figura 1 para avaliar a contractilidade durante a cultura prolongada de células de músculo liso vascular (VSMC) em substratos de PDMS. Para prolongar a viabilidade VSMC, nós utilizamos o genipina composto reticulador. Os substratos para estes vMTFs são projetados para analisar a contratilidade tecido desenvolvido pelo Grosberg et al. 8 Outros métodos vM…

Representative Results

O principal objetivo deste trabalho foi estender a viabilidade de VSMCs micropatterned em substratos PDMS hidrofóbicas. Isto foi conseguido por incorporação de um sistema de entrega de microfluidos para depositar modelado genipina e fibronectina em PDMS (Figura 1). Deposição de proteínas ECM usando entrega microfluídico rendeu transferência de alta fidelidade do padrão de canal com PDMS descalços entre as linhas de genipina e fibronectina (Figura 1D). As células ligadas <stro…

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo que se baseia em tecnologia vMTF anteriormente desenvolvido, permitindo tempos de experiência estendidas mais típico dos caminhos da doença vasculares crônicas ^1,23,24. Para conseguir isso, micropadrão genipina, que tem sido mostrado previamente para fornecer funcionalização de longo prazo de PDMS substratos ^11, usando uma técnica de deposição de microfluidos para se obter lamelas arterial concebido com melhoria da viabilidade do tecido vascular para uso em…

Materials

Coverslip staining rack	Electron Microscopy Sciences	www.emsdiasum.com/	72239-04	Alternative coverslip rack may be used
Microscope cover glass – 25 mm	Fisher Scientific, Inc.	www.fishersci.com	12-545-102	Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	#21458	Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation
1-butanol	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	360465	Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used
Spincoater	Specialty Coating Systems, Inc.	www.scscoatings.com		SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Alternative distributor may be used
Fluorescent microbeads	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	17151	Alternative brand and/or larger size may be used
Silicon wafers	Wafer World, Inc.	www.waferworld.com	2398	Alternative brand and/or size may be used
Photoresist	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height
Contact mask aligner	Suss MicroTec	www.suss.com		MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure
Developer	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 Developer; Hazard: flammable
Tridecafluro-trichlorosilane	UCT Specialties, Inc.	www.unitedchem.com	T2492	Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. )
Surgical biopsy punch	Integra LifeSciences Corp.	www.miltex.com	33-31AA-P/25	Alternative brand and/or size may be used
Genipin	Cayman Chemical	www.caymanchem.com	10010622	Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
1X phosphate buffered saline	Mediatech, Inc.	www.cellgro.com	21-031-CV	Alternative brand may be used
Fibronectin	Corning, Inc.	www.corning.com	356008	Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Inc.	www.lifetechnologies.com	15140-122	Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same
Umbillical artery smooth muscle cells	Lonza	www.lonza.com	CC-2579	Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly
Tyrode's solution components	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	various	Alternative brand may be used for mixing solution
Stereomicroscope	Zeiss	www.zeiss.com	4350020000000000	SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used
Temperature-controlled platform	Warner Instruments	www.warneronline.com	641659; 640352; 641922
Endothelin-1	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	E7764-50UG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained
HA-1077	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	H139-10MG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained