Isolement physique des Endospores partir d'échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la séparation des endospores bactériennes partir de cellules bactériennes végétatives dans les échantillons environnementaux. La formation d'endospores bactériennes est une stratégie de survie, généralement déclenchée par la famine, trouvé dans un certain nombre de groupes de bactéries appartenant à l'embranchement des Firmicutes 1. Bactéries endospores sont bien étudiés, principalement en raison d'un certain nombre de souches sont pathogènes et donc d'une importance médicale (par exemple, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Souches environnementales de bactéries endospores ont été isolés à partir de pratiquement chaque environnement (sol, eau, sédiments, l'air, la glace, intestin humain, les animaux intestin et plus) 1-3. Par conséquent, Firmicutes sont le deuxième embranchement le plus abondant dans les collections de cultures 4.
En raison de leurs protéines du cortex externe et fondamentales de protection robustes, endospores peuvent survivre dans des conditions environnementales extrêmes allant from dessiccation à rayonnement élevé, des températures extrêmes et des produits chimiques nocifs 5. Cette résistance remarquable en fait un défi pour extraire l'ADN des endospores 6-8. Cela explique probablement pourquoi ils ont été négligés dans les études de séquençage de l'environnement 9,10. D'autres méthodes, telles que le ciblage des endospores dans les échantillons environnementaux par des anticorps fluorescents 11, quantification de l'acide dipicolinique (DPA) dans le sol et les sédiments 13 12, la cytométrie de flux 14 ou la pasteurisation et la culture subséquente 15,16 ont été utilisés pour récupérer ou de quantifier dans endospores les échantillons environnementaux. Au cours des dernières années, les méthodes d'extraction d'ADN optimisée, ainsi que des amorces moléculaires spécifiques pour cibler des séquences de gènes spécifiques ont été développés endospores 10,17-20. Cela a contribué à révéler plus de biodiversité au sein de ce groupe de bactéries 21 et a également conduit à des applications dans l'industrie et la médecine pour la détection des endospores, Par exemple dans le lait en poudre 19.
Le protocole présenté ici est basé sur la différence de résistance à physico-chimiques nocifs (conditions telles que la chaleur et détergents) de endospores bactériennes par rapport à des cellules végétatives. Pour détruire les cellules végétatives dans un échantillon, nous appliquons consécutivement la chaleur, le lysozyme et de faibles concentrations de détergents. La durée et la force de ces traitements ont été optimisés afin de ne pas détruire les spores, mais pour lyser toutes les cellules végétatives. Certaines cellules dans une piscine de la cellule de l'environnement sont plus résistants que d'autres, afin d'augmenter la probabilité de détruire toutes les cellules végétatives, nous appliquons trois traitements différents. L'avantage de la nouveauté et cette méthode est que les endospores après le traitement sont encore intacts et peuvent être utilisés pour d'autres analyses en aval. Ceux-ci comprennent l'extraction de l'ADN, la PCR quantitative (qPCR) et amplicon ou le séquençage métagénomique (ciblant spécifiquement le groupe des endospores et donc de réduire dIVERSITÉ, tout en augmentant la couverture). Les endospores pourraient également être utilisés pour la culture ou la quantification en aval par microscopie par fluorescence, cytométrie de flux, ou la détection de DPA. Une caractéristique importante de ce procédé est que, en comparant un échantillon non traité avec un échantillon traité, on peut déduire la quantité et la diversité des endospores dans un échantillon environnemental, en plus de la composante correspondant à des cellules végétatives.
Protocol
Representative Results
Discussion
La résistance des endospores à des facteurs physico-chimiques agressifs externes (par exemple, la température ou détergents) a été utilisé pour mettre au point une méthode pour séparer les endospores bactériennes à partir de cellules végétales dans des échantillons environnementaux. Ceci est la première méthode complète pour isoler à partir d'échantillons environnementaux endospores d'une manière non-destructive. Les procédés antérieurs pour quantifier, détecter ou analy…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent la National Science Foundation suisse pour Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 et n ° 151 948, et Fondation Pierre Mercier Pour la Science.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
Referencias
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