Физическая изоляция эндоспор из проб окружающей среды на целевой лизис вегетативных клеток
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
Цель этой работы заключается в обеспечении протокол для разделения бактериальных эндоспор из растительных бактериальных клеток в пробах окружающей среды. Формирование бактериальных эндоспор является стратегией выживания, как правило, вызваны голода, обнаружили в ряде бактериальных групп, принадлежащих к типу Firmicutes 1. Эндоспоровой формирования бактерии хорошо изучены, в основном, потому, что ряд штаммов патогенных микроорганизмов и являются, следовательно, медицинское значение (например, Bacillus сибирской язвы или Clostridium несговорчивый). Экологические штаммы эндоспоровой формирования бактерий были выделены из практически каждый окружающей среды (почвы, воды, донных отложений, воздуха, льда, человек кишки, животные кишки, и более) 1-3. Таким образом, Firmicutes являются вторым наиболее распространенным типа в коллекции культур 4.
Из-за их внешний выносливых коры и защитные основных белков, эндоспоры может выжить в экстремальных условиях окружающей среды, начиная FRом высыхание высокой радиации, экстремальных температур и вредных химических веществ 5. Этот замечательный сопротивление делает его задача, чтобы извлечь ДНК из эндоспор 6-8. Это, вероятно, объясняет, почему они были упущены в окружающей секвенирования исследований 9,10. Другие методы, такие как нацеливание эндоспор в пробах окружающей среды с флуоресцентными антителами 11, количественное определение дипиколиновая кислоты (DPA) в почве 12 и 13 осадка, проточной цитометрии 14 или пастеризации и последующего культивирования 15,16 были использованы для получения или количественного эндоспоры в пробы окружающей среды. В последние годы методы экстракции ДНК оптимизирована, а также конкретные молекулярные праймеров для гена-мишени последовательности эндоспоровой конкретных были разработаны 10,17-20. Это помогло выявить более биоразнообразия среди этой группы бактерий 21 и также привело к приложениям в промышленности и медицине для обнаружения эндоспор, Например, в сухое молоко 19.
Протокол, представленные здесь, основаны на разнице в устойчивость к вредным физико-химических условий (например, температуры и моющих средств) бактериальных эндоспор относительно вегетативных клеток. Чтобы разрушить вегетативные клетки в образце, мы последовательно применяются тепла, лизоцим и низкие концентрации детергентов. Время и сила этих процедур были оптимизированы таким образом, чтобы не разрушить споры, но лизировать все вегетативные клетки. Некоторые клетки в пуле окружающей клеток более устойчивы, чем другие, так что для того, чтобы повысить вероятность разрушения всех вегетативных клеток, мы используем три различных видов лечения. Преимущество и новизна данного способа является то, что эндоспоры после обработки остаются нетронутыми и могут быть использованы для последующих анализов дальнейших. Они включают в себя добычу ДНК, количественное ПЦР (КПЦР) и ампликон или метагеномных последовательности (таргетинг специально группу эндоспор и таким образом уменьшая Diversity, в то время как увеличение охвата). Эндоспоры также могут быть использованы для последующего культивирования или количественного помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или обнаружение DPA. Важной особенностью данного метода является то, что при сравнении необработанного образца с обработанной пробы, можно сделать вывод, количество и разнообразие эндоспор в окружающей образца в дополнение к компоненту, соответствующую вегетативных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сопротивление эндоспор до внешних агрессивных факторов (физико-химических, например, температуры или моющие средства) был использован для разработки метода для разделения бактериальных эндоспоры из растительных клеток в пробах окружающей среды. Это первый комплексный метод, чт?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, Швейцарский национальный научный фонд для грант № 31003A-132358/1, 31003A_152972 и № 151948, и Fundation Пьер Мерсье залить ла науки.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
Referencias
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America’s Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
