栄養細胞の標的溶解によって環境サンプルからの内生胞子の物理的な分離
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
この研究の目的は、環境試料中の栄養細菌細胞からの細菌の内生胞子を分離するためのプロトコルを提供することにあります。細菌内生胞子の形成は、門ファーミキューテス1に属する細菌群の数で見つかった生き残り戦略、通常は飢餓によって誘発されます。内生胞子形成細菌はよく株の数は、病原体であり、したがって、医療の重要性（例えば、 炭疽菌またはクロストリジウム・ディフィシル ）主な理由は、研究されています。内生胞子形成細菌の環境株は、ほぼすべての環境（土壌、水、底質、大気、氷、人間の腸、動物の腸、およびそれ以上）1-3から単離されています。したがって、ファーミキューテスは、培養コレクション4における第二の最も豊富な門です。
そのため、それらの丈夫な外皮質および保護コアタンパク質の、内生胞子は、FRの範囲の極端な環境条件に耐えることができます高い放射線、極端な温度や有害な化学物質から5 OM乾燥。この驚くべき抵抗は内生胞子6-8からDNAを抽出することが課題になります。彼らは環境配列決定研究9,10に見過ごされてきた理由はここにありそう説明しています。例えば、蛍光抗体11により環境試料中の内生胞子のターゲティングのような他の方法、土壌12と底質13でジピコリン酸の定量（DPA）は、14フローサイトメトリーまたは低温殺菌し、その後の栽培15,16で内生胞子を取得または定量化するために使用されています環境サンプル。近年では、最適化されたDNA抽出法と同様に、特定の分子的プライマー内生胞子特異的遺伝子配列を標的にする10,17-20を開発されています。これは、細菌21のこのグループの中でより多くの生物多様性を明らかにすることができましたし、また内生胞子の検出のための産業や医療への応用につながっています、粉乳19で例えば。
ここで紹介するプロトコルは、栄養細胞からの相対細菌内生胞子の（例えば、熱や洗剤など）の有害な物理化学的条件に対する抵抗の差に基づいています。サンプル中の栄養細胞を破壊するために、我々は連続的に熱、リゾチーム及び界面活性剤の低濃度を適用します。これらの治療の時間と強度は胞子を破壊するが、すべての栄養細胞を溶解しないように最適化されています。環境セル・プール内のいくつかの細胞は他のものより耐性があるので、すべての栄養細胞を破壊する可能性を高めるために、我々は、3つの異なる治療法を適用します。この方法の利点および新規性は、処置後の内生胞子はまだ無傷であり、さらなる下流の分析のために使用することができることです。これらは、DNA抽出、定量PCR（定量PCR）、およびアンプリコンまたはメタゲノムシーケンシング（具体的には内生胞子のグループをターゲットとするため、Dを減らすことが含まれますiversity、）カバレッジ向上させながら。内生胞子はまた、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはDPAの検出によって下流培養または定量化のために使用することができます。この方法の重要な特徴は、処理された試料と未処理試料と比較することにより、一つの細胞を栄養に対応する構成要素に加えて、環境試料中の内生胞子の数と多様性を推定することができることです。
Protocol
Representative Results
Discussion
外部積極的な物理化学的要因（例えば、温度や洗剤）の内生胞子の抵抗は環境試料中の栄養細胞から細菌内生胞子を分離する方法を考案するために使用されました。これは、非破壊的な方法で環境サンプルから内生胞子を単離するための最初の包括的方法です。サンプル中の内生胞子を、定量検出または分析する従来の方法は、ジピコリン酸または特定のマーカー遺伝子として?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、助成金番号31003A-1分の132358、31003A_152972および第151948スイス国立科学財団を承認し、Fundationピエール・メルシエはラ・サイエンスを注ぎます。
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
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