בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin
Summary
כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.
Abstract
פונקציונלי in vivo ההדמיה הפכה לגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הפונקציה ופיזיולוגיה של תאי מוח ומבנים של עניין. לאחרונה שיטה חדשה של Ca 2 + -imaging באמצעות GFP-aequorin כתב bioluminescent (GA) פותחה. טכניקה חדשה זו מסתמכת על השילוב של גני GFP וaequorin, ייצור מסוגל מחייב סידן ומולקולה – בתוספת coelenterazine cofactor – פולטות אור בהיר שיכול להיות במעקב באמצעות אספן פוטון. קווים מהונדסים נושאים את גן GFP-aequorin כבר נוצרו עבור שני עכברים ודרוזופילה. בדרוזופילה, גן GFP-aequorin הושם תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי GAL4 / כטב"מ המאפשרת ביטוי ממוקד והדמיה בתוך המוח. שיטה זו לאחר מכן הוצגה להיות מסוגלת לזהות שני פנימה Ca 2 + -transients וCa 2 + -released מחנויות פנימיות. והכי חשוב זה מאפשר לזמן רב יותר בהקלטה רציפה, הדמיה בעומקים גדולים יותר במוח, והקלטה ברזולוציות גבוהות זמניות (עד 8.3 אלפיות שני). כאן אנו מציגים שיטה הבסיסית לשימוש בהדמית bioluminescent להקליט ולנתח Ca 2 + -activity בתוך גופי פטריות, מבנה מרכזי ללמידה וזיכרון במוח הזבוב.
Introduction
הדפוסים והתפקוד של פעילות במוח והמבנים הדיסקרטיים הבסיסיים כבר זמן רב על שטח של מחקר אינטנסיבי בתחום מדעי המוח. אולי חלק מהגישות המוצלחות המוקדמות נהגו לטפל בבעיה זו היו מדידה פיזיולוגית ישירה של השינוי בפעילות חשמלית – שיטות חלופיות עם זאת, המאפשרות הדמיה חיה של שינויים בריכוזי מתח, pH או סידן (כמו פרוקסי לפעילות) הביאה יכולות נוספות ל המחקר של פעילות עצבית 1. טכניקות הדמיה לבצע מגוון רחב של יתרונות כגון הפולשנות מופחתת ואת היכולת לעקוב אחר פעילות בתוך מבני מוח כולו. יתר על כן בבעלי חיים עם גנטיקה צייתנית כוללים זבוב הפירות דרוזופילה, פיתוח של אינדיקטורים סידן מקודדים גנטיים, כגון Cameleon, GCaMPs ואחרים 1 איפשר לחוקרים לעקוב אחר תאי עצב בודדים, אוכלוסיות נוירונים וכל מוחמבנים. בעוד שיטות ניאון מסורתיות יותר סידן הדמיה באמצעות GCaMPs (GFP התמזג calmodulin) או סריג (CFP ו YFP התמזג calmodulin) הוכיח להיות טכניקות שימושיות מתן החלטת מרחב ובזמן טוב, התהליך הבסיסי של עירור אור מוליד כמה מגבלות עליה ניסיוני יישומים. בשל האופי של עירור אור, autofluorescence, צילום הלבנת, וphototoxicity מיוצרים באופן בלתי נמנע, שכתוצאה מכך מגביל את העומק של המבנים שניתן הדמיה, משך ההקלטות כמו גם המשכיות בזמן אמת של הקלטה. במילים אחרות, הקלטות חייבות לעתים קרובות נעשות לסירוגין, כדי למנוע תופעות לוואי בלתי רצויים אלה.
בגלל אתגרים אלה, שיטות חלופיות נוספות של הדמיה סידן פותחו. אחת השיטות המבטיחות ביותר הוא הדמיה bioluminescent, אשר מסתמכת על אור מופק באמצעות תגובה האנזימטית לאחר סידן מחייב. Bioluminescenהדמיה לא אינה דורשת עירור אור וכתוצאה מכך אינו חווה אותם הקשיים כמו סידן הדמיה קונבנציונלית. כתב bioluminescent Aequorin – מבודד מויקטוריה Aequorea, אותו המדוזות שממנו GFP גם isolated- נקשר סידן באמצעות שלושה מבני יד EF ועובר שינוי קונפורמציה, מוביל לחמצון של coelenterazine cofactor ואת שחרורו של אור הכחול (λ = 469 ננומטר) 2,3. יש Aequorin זיקה נמוכה מאוד ל( ד K = 10 מיקרומטר) סידן שהופך אותו אידיאלי עבור ניטור ארעיים סידן משום שהיא מייצרת רעש רקע מעט מאוד ולא מפריעה למערכת אגירת סידן תוך תאי 4. למרות aequorin כבר השתמש בעבר כדי לפקח על התהליך של אינדוקציה עצבית בביצה הצפרדעים 5 האור המיוצר הוא עמום מדי לשימוש עבור הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית. במאמץ להתמודד עם אתגר זה, פיליפ Br ו# 251; בואו ועמיתיו במכון פסטר נוצרו מבנה גנטי פיוזינג GFP וaequorin גנים, מחקה את המדינה האם של המדוזה בתוך 4. מוצר גן היתוך זה נקשר סידן שוב באמצעות שלושת מבני EF היד של aequorin, שעובר שינוי קונפורמציה המוביל לחמצון של coelenterazine, המעביר אנרגיה שאינה radiatively לGFP. תוצאות זה העברת אנרגיה בשחרורו של אור ירוק (λ = 509 ננומטר) מGFP, במקום אור הכחול מaequorin. ההיתוך של ה- GFP וaequorin גם מקנה יציבות חלבון גדולה יותר עוזרת אור תוצרת חלבון היתוך 19-65 פעמים בהירות יותר aequorin לבד 4. שימוש בגישה bioluminescent בתוך המוח מרחיבה את היישום הניסיוני הנוכחי של סידן הדמיה הן מבחינת משך ההקלטה רציפה ומספר המבנים במוח שיכול להיות מוקלט. באופן כללי בהקשר של עבודה קודמת זה אומר ששניהם גלובלי וגדול יותרמגוון של "פעילות" regionalized של המוח יכול להיות במעקב (באמצעות פרוקסי של ארעיים סידן). יותר מכך פעילות יכולה להיות במעקב למשך זמן ארוכה יותר, בזמן אמת ובסיס מתמשך, אשר משאיל את עצמו בקלות למרדף של הבנה מלאה של תפקוד בסיסי במוח.
בשנים האחרונות, המעבדה ואחרים שלנו פיתחו זבובים מהונדסים המבטאים את ה- GFP-aequorin תחת השליטה של מערכת הביטוי בינארי (GAL4 / כטב"מ-GFP-aequorin) 5,6. השתמשנו פליטת אור GFP-aequorin לפעילות שיא המיוצרת על ידי גירויים טבעיים כגון ריח 7,8, כמו גם המרכיבים התאיים למדו ויסות -activity Ca 2 + בגופי הפטרייה בעקבות גירוי קולטן האצטילכולין ידי יישום ניקוטינית ישיר 9. בנוסף, יש לנו גם משמש GFP-aequorin להתייחס מספר השאלות ניסיוניות שלא היו מסוגל לטפל בעבר, כמו לטווח ארוךהדמיה של ארעיים סידן ספונטני והדמיה של מבני מוח עמוקים יותר 10. לאחרונה, השתמשנו במערכת / כטב"מ GAL4 להביע קולט ATP היונקים P2X 2 11 ערוץ קטיון, בנוירונים ההקרנה (PNS) והשתמשתי במערכת LexA להביע GFP-aequorin בגופי הפטריות (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (באדיבות ב פייפר, Janelia Farm, ארה"ב). זה אפשר לנו להפעיל את PNS על ידי יישום של ה- ATP, אשר בתורו מפעיל את גוף הפטרייה (יעד במורד הזרם של PNS), מחקה יותר תנאים טבעיים, כגון התגובה לגירוי ריח. בסך הכל טכניקה זו משלבת P2X 2 וה- GFP-aequorin מרחיבה את האפשרויות הניסיוניות. באופן כללי היא מציעה את ההזדמנות כדי להבין טוב יותר את דפוסי הפעילות במוח, ייזום מחקרים חדשים על איך גירויים והפרעות שונים יכולים לשנות את הדפוסים הבסיסיים של פעילות.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישת GFP-aequorin פותחה לאחרונה מבוסס bioluminescent מוצגת כאן מאפשרת הקלטה פונקציונלית vivo של -activity Ca 2 + בתאי עצב שונים, כמו גם אם ארצה בכך, בסוג של תאים כמו תאי stellate כליות אחרים כפי שדווחה באל Cabrero et. 2013 5.
ש?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Referencias
- Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
