Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım
Summary
Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.
Abstract
In vivo görüntüleme Fonksiyonel fonksiyonu ve beyin hücreleri ve ilgi yapıların fizyolojisi incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. En son ışıldar haberci GFP Aequorini (GA) kullanılarak -imaging Ca 2 yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kofaktörü koelenterazin ilavesi ile – – foton toplayıcı ile izlenebilir parlak ışık yayan Bu yeni teknik kalsiyum bağlanması ve bir moleküldür üreten GFP ve aequorin genlerin füzyonu kullanır. GFP-aequorin geni taşıyan transjenik çizgiler fareler ve Drosophila hem de üretilmiştir. Drosophila olarak, GFP-aequorin geni beyin içinde hedeflenen ifade ve görüntüleme için izin GAL4 / UAS ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında yerleştirilmiştir. Bu yöntem, daha sonra tespit etme kabiliyetine sahip olduğu gösterilmiştir hem Ca içeri 2 + -transients ve Ca +2, iç depolardan -released. En önemlisi de sürekli kayıt, beynin içinde büyük derinliklerde görüntüleme daha büyük bir süre için izin verir, ve (8.3 milisaniye kadar) yüksek temporal çözünürlükte kayıt. Burada kayıt ve Ca mantar organları içinde 2+ -Aktiflik, sinek beyinde öğrenme ve hafıza merkezi bir yapı analiz etmek bioluminescent görüntüleme kullanılarak temel yöntem mevcut.
Introduction
Temel desenlendirme ve beyin ve ayrık yapı içinde faaliyet işlevi uzun nörobilim alanındaki yoğun bir çalışma alanı olmuştur. Belki de bu sorunu gidermek için kullanılan en eski başarılı yaklaşımların bazı elektrik aktivitesindeki değişikliğin doğrudan fizyolojik ölçümü vardı – ek yetenekleri getirdi (aktivite için proxy olarak) gerilim, pH veya kalsiyum konsantrasyonları değişikliklerin canlı görüntüleme izin ancak alternatif yöntemler nöronal aktivitenin 1 çalışma. Görüntüleme teknikleri, azaltılmış invaziv ve bütün beyin yapıları içinde etkinliğini izlemek için yeteneği gibi avantajları geniş bir yelpazeye taşırlar. Ayrıca meyve gibi uysal genetik hayvanlarda Drosophila gibi cameleon, GCaMPs ve diğerleri gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, gelişimini sinek 1 tek nöronlar, nöronal nüfus ve tüm beyni izlemek için araştırmacılar izinyapıları. Daha geleneksel floresan kalsiyum görüntüleme yöntemleri (kalmodulin kaynaştırılmış CFP ve YFP) (kalmodulin erimiş GFP) ya da FRET GCaMPs kullanırken iyi mekansal ve zamansal çözünürlük sağlayan kullanışlı teknikler olduklarını kanıtladılar, ışık uyarma altında yatan sürecinin deneysel bazı sınırlamalar doğurur uygulamaları. Nedeniyle sonuç görüntülü olabilir yapıların derinliğini sınırlar kaçınılmaz üretilen hafif uyarma, otofloresansı, fotoğraf ağartma ve fototoksisite doğası için, kayıtların süresi yanı sıra kayıt gerçek zamanlı süreklilik. Diğer bir deyişle, kayıtlar genellikle bu istenmeyen yan etkileri önlemek için aralıklı olarak gerçekleştirilmelidir.
Çünkü bu zorlukların, kalsiyum görüntüleme ek alternatif yöntemler geliştirilmiştir. En umut verici yöntemlerden biri kalsiyum bağlama sonra enzimatik reaksiyon ile üretilen ışık dayanır biyoluminesen görüntüleme vardır. Bioluminescent görüntüleme geleneksel kalsiyum görüntüleme aynı zorluklar yaşamaya değil dolayısıyla hafif uyarma gerektirmez ve etmez. Bio-ışıldar haberci Aequorin – Aequorea victoria izole λ (GFP da isolated- edildiği aynı Jellyfish üç EF ayak yapılarının ile kalsiyum bağlanır ve kofaktörü koelenterazin oksidasyonu ve mavi ışık serbest bırakılmasına yol açacak bir konformasyonal değişiklik geçirmektedir = 469 nm) 2,3. Aequorin çok az arka plan gürültü üreten ve hücre içi kalsiyum tamponlama sistemi 4 ile karışmaz çünkü geçici kalsiyum kontrolü için ideal hale getirir, kalsiyum (Kd = 10 uM) için çok düşük bir çekicilikleri vardır. Aequorin önce Xenopus yumurta 5 üretilen ışık nöral indüksiyon sürecini izlemek için kullanılır olmasına rağmen nöronal aktivitenin gerçek zamanlı görüntüleme için kullanmak için çok loş. Bu meydan okuma, Philippe Br & gidermek için bir çaba içinde251., Pasteur Enstitüsü'nde izin ve arkadaşları denizanası 4 içinde yerli devlet taklit, GFP füzyon ve genleri Aequorin bir genetik yapının yarattı. Bu füzyon gen ürünü GFP olmayan radyatif enerjiyi aktaran koelenterazin, oksidasyonu için önde gelen bir yapısal değişikliğe uğrar aequorin üç EF eli yapıları, üzerinden tekrar kalsiyumu bağlar. Yerine aequorin mavi ışık GFP yeşil ışık (λ = 509 nm) sürümünde bu enerji transfer sonuçları. GFP ve aequorin füzyon aynı zamanda tek başına 4 Aequorin daha 19 65 kat daha parlak füzyon proteini üretmek ışık yardımcı büyük protein stabilitesini bahşeder. Beynin içinde bir biyolüminesens yaklaşımı kullanarak sürekli kayıt süresi ve kaydedilebilir beyin içindeki yapıların sayısı bakımından hem de kalsiyum görüntüleme mevcut deneysel uygulama genişletir. Geniş önceki çalışmaları bağlamında bu hem küresel hem de daha büyük bir anlamıBeynin bölgeselleştirilmiş "etkinliği" çeşitliliği (kalsiyum transientler proxy üzerinden) izlenebilir. Daha da önemlisi aktivite kolaylıkla beyinde bazal fonksiyon tam bir anlayış peşinde kendisini ödünç bir gerçek zamanlı ve sürekli olarak, içinde, daha uzun süre izlenebilir.
Son birkaç yıl içinde, laboratuar ve diğerleri, ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında GFP-Aequorini (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6 ifade eden transgenik sinekler geliştirdik. Biz doğrudan nikotinik uygulama 9 ile asetilkolin reseptör stimülasyonu aşağıdaki mantar organları Ca 2+ -Aktiflik modüle gibi kokusu 7,8 gibi doğal uyaranlara yanı sıra çalışılan hücresel bileşenleri tarafından üretilen kayıt faaliyetine GFP-aequorin biyoparlaklık kullandık. Buna ek olarak, biz de uzun vadeli gibi önceden ele alınması mümkün olmamıştır deneysel sorular, bir dizi adrese GFP-Aequorini kullanmışSpontan kalsiyum geçici ve derin beyin yapıları 10 görselleştirme görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, biz memeli ATP reseptör P2X 2 11 projeksiyon nöronlarının bir katyon kanalı, (PNS) ifade GAL4 / UAS sistemi kullanılmaktadır ve (MB247-LeXA mantar organları GFP-Aequorini ifade etmek LeXA sistemini kullandık, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. Pfeiffer, Janelia Çiftliği, ABD) bir nezaket. Bu bize böyle bir koku uyarana karşı tepki olarak daha doğal koşullar, taklit, sırayla mantar organları (PNS bir aşağı hedef) aktive ATP, uygulanmasıyla Fiziksel Durum etkinleştirmek için izin verdi. Genel olarak bu P2X 2 birleştirerek tekniği ve GFP-aequorin deneysel olanakları genişletir. Geniş farklı uyaranlar ve tedirginlikler faaliyet bazal desenlendirme değiştirebilir nasıl yeni çalışmaları başlatarak, daha beyindeki aktivite kalıplarını anlamak için bir fırsat sunuyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cabrero ve ark belirtildiği gibi burada sunulan yeni geliştirilmiş biyolojik olarak ışık veren bazlı GFP aequorin bir yaklaşım, böbrek stellat hücreleri gibi diğer hücre tür, hem de istenirse gibi farklı nöronlarında Ca 2 + -Aktiflik de vivo fonksiyonel bir kayıt sağlar. 2013 5.
Değişiklikler, sorun çekim, ek bileşenler ve kritik adımlar
Drosoph…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Referencias
- Martin, J.-R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose? J Neurogenet. 22(3), 285-307, (2008).
- Shimomura, O., & Johnson, F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75(6) 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F.H., & Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62(1), 1-8, (1963).
- Baubet, V. et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97(13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S.A., Dow, J.A.T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280(1757), 2012-2943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S.E., Daguzan, C., Moreau, M., & Miller, A.L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113(19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J.-R., Rogers, K.L., Chagneau, C., & Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2(3), e275, (2007).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., & Martin, J.-R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213(24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., Réal, E., & Martin, J.-R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105, (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., & Martin, J.-R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2(2), 0054-0068, (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M.S., & Martin, J.-R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833(7), 1632-1640, (2013).
- Lima, S.Q., & Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121(1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., & Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14(5), 373-378, (1993).
- Berridge, M.J., Bootman, M.D., & Roderick, H.L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4(7), 517-529, (2003).
- Fiala, A., & Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003(174), PL6, (2003).
- Wang, J.W., Wong, A.M., Flores, J., Vosshall, L.B., & Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112(2), 271-282, (2003).
- Wilson, R.I., Turner, G.C., & Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303(5656), 366-370, (2004).
