In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina
Summary
Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.
Abstract
Funzionale imaging in vivo è diventato un approccio efficace per studiare la funzione e la fisiologia delle cellule e strutture di interesse cerebrali. Recentemente è stato sviluppato un nuovo metodo di Ca 2+ -imaging utilizzando il reporter bioluminescenti GFP-aequorina (GA). Questa nuova tecnica si basa sulla fusione dei geni GFP e equorina, producendo una molecola in grado di legare il calcio e – con l'aggiunta del suo cofattore coelenterazine – emettono luce che può essere monitorato attraverso un collettore fotone. Linee transgeniche che trasportano il gene GFP-equorina sono stati generati per entrambi i topi e Drosophila. In Drosophila, il gene GFP-equorina è stato posto sotto il controllo del sistema di espressione binario GAL4 / UAS consentendo espressione mirata di imaging e nel cervello. Questo metodo è stato successivamente dimostrato di essere in grado di rilevare sia verso l'interno di Ca 2+ -transients e Ca 2+ -released dai depositi interni. Soprattutto consente una maggiore durata nel registrazione continua, imaging a maggiori profondità all'interno del cervello, e la registrazione ad alta risoluzione temporale (fino a 8,3 msec). Qui vi presentiamo il metodo di base per l'utilizzo di imaging bioluminescente per registrare e analizzare Ca 2+ -Attività in seno agli organi di funghi, una struttura centrale di apprendimento e la memoria nel cervello mosca.
Introduction
Il patterning e la funzione di attività all'interno del cervello e le sue strutture discrete fondamentali sono stati a lungo una zona di intenso studio nel campo delle neuroscienze. Forse alcuni dei primi approcci di successo utilizzati per risolvere questo problema sono stati la misura fisiologica diretta della variazione dell'attività elettrica – metodi tuttavia alternativi che consentano l'imaging dal vivo di cambiamenti nelle concentrazioni di tensione, di pH o di calcio (come proxy per attività) hanno portato ulteriori funzionalità a lo studio dell'attività neuronale 1. Tecniche di imaging trasportare una vasta gamma di vantaggi, come riduzione invasività e la possibilità di monitorare l'attività all'interno delle strutture intere del cervello. Inoltre, in animali con la genetica trattabili compreso moscerino della frutta Drosophila, sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati, come Cameleon, GCaMPs e altri 1 hanno permesso ai ricercatori di monitorare singoli neuroni, popolazioni neuronali e tutto il cervellostrutture. Mentre altri metodi di imaging di calcio fluorescenti tradizionali utilizzando GCaMPs (GFP fusa al calmodulina) o FRET (PCP e YFP fuso con calmodulina) hanno dimostrato di essere le tecniche utili che forniscono una buona risoluzione spaziale e temporale, il processo alla base dell'eccitazione luce genera alcune limitazioni sulla sua sperimentale applicazioni. A causa della natura della luce di eccitazione, autofluorescenza, fotometabolismo e fototossicità vengono inevitabilmente prodotte, che limita di conseguenza la profondità delle strutture che possono essere esposte, la durata della registrazione e la continuità tempo reale della registrazione. In altre parole, registrazioni devono spesso essere eseguite in modo intermittente per evitare questi effetti collaterali indesiderati.
A causa di questi problemi, sono stati sviluppati metodi alternativi aggiuntivi calcium imaging. Uno dei metodi più promettenti è l'imaging bioluminescente, che si basa sulla luce prodotta attraverso una reazione enzimatica dopo il legame del calcio. Bioluminescent di imaging non necessita di eccitazione luce e di conseguenza non sperimentare le stesse difficoltà di imaging di calcio tradizionale. Il reporter bioluminescente equorina – isolato da Aequorea victoria, la stessa Medusa da cui GFP è stato isolated- anche lega il calcio attraverso le sue tre strutture a mano EF e subisce un cambiamento conformazionale, che porta alla ossidazione del suo coelenterazine cofattore e il rilascio di luce blu (λ = 469 nm) 2,3. Equorina ha una bassa affinità per il calcio (K d = 10 mM) che lo rende ideale per il monitoraggio transienti di calcio perché produce poco rumore di fondo e non interferisce con il sistema tampone calcio intracellulare 4. Anche se equorina è stato precedentemente utilizzato per monitorare il processo di induzione neurale nell'uovo Xenopus 5 la luce prodotta è troppo debole da utilizzare per l'imaging in tempo reale di attività neuronale. Nel tentativo di affrontare questa sfida, Philippe Br &# 251; affitto e colleghi presso l'Istituto Pasteur ha creato un costrutto genetico fusione GFP e equorina geni, imitando lo stato nativo all'interno del meduse 4. Questo prodotto del gene di fusione lega nuovo calcio attraverso le tre strutture mano EF di equorina, che subisce un cambiamento conformazionale che porta alla ossidazione del coelenterazine, che trasferisce l'energia non radiativamente alla GFP. Questo trasferimento di energia provoca il rilascio di luce verde (λ = 509 nm) da GFP, invece di luce blu da equorina. La fusione di GFP e equorina conferisce anche una maggiore stabilità proteica aiutare la proteina di fusione producono luce da 19 a 65 volte più luminosa aequorina solo 4. Usando un approccio bioluminescente nel cervello espande l'attuale applicazione sperimentale dell'imaging calcio sia in termini di durata di registrazione continua e il numero di strutture all'interno del cervello che può essere registrato. Ampiamente nel contesto di lavoro precedente significa che sia globale e una maggiorevarietà di regionalizzato "attività" del cervello può essere monitorato (attraverso il proxy di transienti di calcio). Ancora più importante attività può essere monitorato per più, in un tempo reale e base continua, che si presta facilmente al perseguimento di una completa comprensione della funzione basale nel cervello.
Negli ultimi anni, il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato mosche transgeniche esprimenti GFP-equorina sotto il controllo del sistema di espressione binario (GAL4 / UAS-GFP-equorina) 5,6. Abbiamo usato GFP-equorina bioluminescenza all'attività disco prodotto da stimoli naturali come profumo 7,8, nonché studiato i componenti cellulari modulanti Ca 2+ -Attività nei corpi fungo seguenti acetilcolina recettore stimolazione per applicazione diretta nicotinico 9. Inoltre, abbiamo utilizzato anche GFP-aequorina ad affrontare una serie di questioni sperimentali che non hanno potuto essere affrontate in precedenza, come a lungo terminel'imaging di transienti di calcio spontanee e visualizzazione delle strutture cerebrali profonde 10. Più di recente, abbiamo utilizzato il sistema / UAS GAL4 per esprimere il recettore dei mammiferi ATP P2X 2 11 un canale cationico, nei neuroni di proiezione (PN) e utilizzato il sistema LexA di esprimere GFP-aequorina nei corpi di funghi (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (una per gentile concessione di B. Pfeiffer, Janelia Fattoria, Stati Uniti d'America). Questo ha permesso di attivare l'PN per applicazione di ATP, che a sua volta attiva i corpi fungo (un bersaglio a valle del PN), simulando condizioni più naturali, come la risposta ad uno stimolo odore. Nel complesso questa tecnica che unisce P2X 2 e GFP-aequorina espande le possibilità sperimentali. In linea di massima, offre la possibilità di capire meglio i modelli di attività nel cervello, avviando nuovi studi su come i diversi stimoli e perturbazioni possono alterare il patterning basale di attività.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'approccio GFP-equorina basato bioluminescenti-recentemente sviluppato qui presentato permette in vivo registrazione funzionale Ca 2+ -Attività in neuroni diversi, così come se lo si desidera, in altri tipi di cellule, come le cellule stellate rene come riportato in Cabrero et al. 2013 5.
Modifiche, guasti, componenti aggiuntivi e passaggi critici
Drosophila Zootecnica</stro…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Referencias
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