Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Mit der schnellen Entwicklung von Stammzell-basierten Gentherapie gegen HIV, ist es Anforderung Pressen für ein Tiermodell die hämatopoetische Differenzierung und Immunfunktion der genetisch veränderten Zellen zu untersuchen. Der humanisierte Knochenmark / Leber / Thymus (BLT) Maus-Modell ermöglicht die vollständige Rekonstitution eines menschlichen Immunsystems in der Peripherie, die T-Zellen, B-Zellen umfasst, NK-Zellen und Monozyten. Der menschliche Thymus-Implantat ermöglicht auch die Thymus-Auswahl von T-Zellen in autologem Thymusgewebes. Neben der Untersuchung der HIV-Infektion, steht das Modell als leistungsfähiges Werkzeug Differenzierung, Entwicklung und Funktion von Zellen, die aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) abgeleitet zu studieren. Hier beschreiben wir den Aufbau von humanisierten nicht obese diabetic (NOD) -severe kombiniert immunodeficient (SCID) -common gamma – Kette Knockout (c γ – / -) -Bone Mark / Leber / Thymus (NSG-BLT) Mäuse mit HSZ transduziert mit CD4 chimären Antigenrezeptoren (CD4CAR)Lentivirusvektor. Wir zeigen, dass die CD4CAR HSCs erfolgreich in mehrere Linien differenzieren können, und Anti-HIV-Aktivität aufweisen. Das Ziel der Studie ist es, die Verwendung von NSG-BLT – Mausmodell als ein in vivo – Modell für engineered Immunität gegen HIV zu demonstrieren. Es ist erwähnenswert, dass, weil Lentiviren und menschlichem Gewebe verwendet wird, Experimente und Operationen sollten in der Klasse II Biosicherheitswerkbank in einem Biosafety Level 2 (BSL2) mit besonderen Vorsichtsmaßnahmen (BSL2 +) Einrichtung durchgeführt werden.
Introduction
Trotz des Erfolgs der kombinierten antiretroviralen Therapie, ist eine HIV-Infektion noch eine lebenslange Krankheit. Die zelluläre Immunantwort gegen HIV spielt sehr wichtige Rolle in der HIV-Replikation steuern. Die jüngsten Fortschritte in der Stammzellmanipulation hat sich für die rasche Entwicklung der Gentherapie Ansätze zur HIV – Behandlung 1-3 erlaubt. Infolgedessen ist es wichtig , einen geeigneten Tiermodell zu haben , die der Wirksamkeit von zellbasierten Therapien gegen HIV in vivo Studie erlaubt.
Arbeiten mit HIV in Tiermodellen wird durch die Tatsache kompliziert, daß nur das Virus menschliche Zellen infiziert. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben die Wissenschaftler zur Verwendung von Krankheitsmodellen wie dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) in Rhesus – Makaken gegriffen 4,5. Leider gibt es in diesem Modell wesentliche Einschränkungen aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen den Arten und die Unterschiede zwischen SIV und HIV. Darüber hinaus sind nur hoch spezialisierte Einrichtungen sind capable der Arbeit mit nicht-menschlichen Primaten zu unterstützen und jedem Makaken erfordert eine große Investition. Somit besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Modell, das das menschliche Immunsystem verwendet, die mit HIV-Infektion / Pathogenese geeignet ist, und ist weniger wirtschaftlich unerschwinglich.
Die nicht-obese diabetic (NOD) -severe kombiniert immunodeficient (SCID) -common gamma – Kette Knockout (c γ – / -) (oder NSG) Blut / Leber / Thymus (BLT) humanisierten Mausmodell nachgewiesen wird zunehmend ein wichtiges Instrument sein , HIV-Infektion zu studieren. Hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) und fötalen Thymus durch Implantation sind die Mäuse entwickeln können und ein menschliches Immunsystem 1-3 rekapitulieren. Eine Art von stammzellbasierten Gentherapie beinhaltet peripheren T-Zellen "Umleitung" HIV zum Ziel durch hämatopoetische Stammzellen Neuprogrammierung (HSZ) in Antigen-spezifischen T-Zellen zu unterscheiden. Wir haben bereits gezeigt, dass Engineering-HSCs mit einem molekularen geklont Anti-HIV-spezifischen T-Zell-reRezeptor (TCR) gegen die SL9 Epitop (Aminosäuren 77-85; SLYNTVATL) von HIV-1 Gag können Stammzellen zu bilden , reife T – Zellen leiten , die HIV – Replikation in dem humanisierten NSG-BLT Maus 6 – Modell unterdrücken. Der Nachteil eines molekularen geklont TCR ist, dass es zu einem bestimmten humanen Leukozyten-Antigen (HLA) Subtyp beschränkt ist, die die Anwendung dieser Therapie beschränken. Chimäre Antigenrezeptoren (CAR), auf der anderen Seite, ist universell für alle HLA-Subtypen angewendet werden. Erste Studien wurden ein Auto mit den extrazellulären und Transmembrandomänen des humanen CD4 an die intrazelluläre ζ fusioniert konstruiert durchgeführt unter Verwendung von Signal-Domäne von CD3 (der so genannten CD4ζCAR). CD4ζCAR ausgedrückt auf CD8 – T – Zellen können HIV envelope erkennen und eine zytotoxische T – Zellantwort auslösen, die zu der durch ein T – Zell – Rezeptor – vermittelten 7 ähnlich ist. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass menschliche HSCs mit CD4ζCAR modifiziert werden, die dann in mehrere hämatopoetische li unterscheiden kannneages, einschließlich funktionelle T – Zellen unterdrücken kann die HIV – Replikation in dem humanisierten Maus – Modell 8. Mit dem schnellen Fortschritt in chimären Antigen – Rezeptor – Therapien für Krebs 9 und der laufenden Charakterisierung potent breiten neutralisierenden Antikörpern gegen HIV 10-12, die die Konstruktion von Einzelketten – Antikörper CARs ermöglichen, ist es erkennbar , dass viele neue Kandidaten – Konstrukte, zusätzlich zu CD4ζCAR wird für Stammzellen basierten Gentherapie von HIV-Erkrankungen und andere Erkrankungen erzeugt und getestet werden. Darüber hinaus kann der humanisierte NSG-BLT – Mausmodell , diese antigenspezifischen CARs enthält auch ein nützliches Instrument zur eng humanen T – Zell – Antworten in vivo zu untersuchen. Wichtig ist , unterscheidet sich unser Protokoll der letzten Zeit beschriebenen Verfahren zur Konstruktion von humanisierten von BLT Mäuse 13-15, dass das HSZ in gallertartig Proteinmischung wird 16 anstelle von fötalen Leberstämme verwendet. Dieses Protokoll beschreibt: 1) Aufbau von humanized BLT Mäuse mit CD4ζCAR entwickelt; und 2) Charakterisierung der Differenzierung der genetisch modifizierten Zellen; und 3) Charakterisierung der Funktionalität der genetisch modifizierten Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit CAR und HSC-basierten entwickelt Immunität gewinnt an Dynamik zu klinischen Studien, ist es wichtig, eine richtige Tiermodell zu haben, um genau die Differenzierung und Funktion dieser gentechnisch veränderten Zellen zu untersuchen. In diesem Protokoll beschrieben wir die Methoden für die Konstruktion und Prüfung der humanisierten Mäuse mit genetisch veränderten Stammzellen gentechnisch gegen HIV. Es ist wichtig, eine effiziente Transduktion von Stammzellen vor der Transplantation zu haben. Jedoch aufgrund der…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
Referencias
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice–an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
