This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
עם ההתפתחות המהירה של טיפולים גן מבוססי תאי גזע נגד HIV, יש לחיצה דרישה במודל חיה ללמוד את הבידול hematopoietic ותפקוד מערכת החיסון של תאים מהונדסים גנטית. The-מוח העצם האנושי / כבד / קורנית (BLT) במודל של עכברים מאפשר כינון מחדש מלא של מערכת חיסון אנושית בפריפריה, הכוללת תאי T, תאי B, תאי NK ומונוציטים. השתל הרתי האדם גם מאפשר לבחירה הרתי של תאי T ברקמות הרתי עצמיות. בנוסף המחקר של הידבקות ב- HIV, המודל עומד ככלי רב עצמה כדי ללמוד בידול, פיתוח פונקציונלי של תאים שמקורם בתאי גזע hematopoietic (HSCs). כאן נתאר את בניית אנושי ללא השמנת יתר סוכרת (NOD) -severe immunodeficient משולב (SCID) בנוקאאוט שרשרת גמא -common (ג γ – / -) -Bone מח / כבד / קורנית (NSG-BLT) עכברים עם HSCs transduced עם קולטן אנטיגן chimeric CD4 (CD4CAR)וקטור lentivirus. אנו מראים כי CD4CAR HSCs יכול להבחין בהצלחה לתוך שושלות מרובות יש פעילות אנטי HIV. מטרת המחקר היא להדגים את השימוש במודל עכבר NSG-BLT כמודל in vivo לחסינות מהונדסת נגד HIV. ראוי לציין, כי lentivirus ורקמות אדם משמשים, ניסויים וניתוחים צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II בתוך 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) עם אמצעי זהירות מיוחדת מתקן (BSL2 +).
למרות ההצלחה של טיפול אנטי retroviral בשילוב, הידבקות ב- HIV היא עדיין מחלה לכל חיים. התגובה החיסונית התאית נגד HIV משחקת תפקיד חשוב מאוד מצליח לשלוט בהתרבות נגיף. התקדמות מניפולציה בתאי גזע אפשרה ההתפתחות המהירה של ריפוי גנטי גישות ל- HIV טיפול 1-3. כתוצאה מכך, חשוב יש במודל חיה נאה המאפשר במחקר vivo של היעילות של טיפולים מבוססי תאים נגד HIV.
עבודה עם HIV במודלים של בעלי חיים הוא מסובך בשל העובדה כי הנגיף מדביק תאים אנושיים בלבד. כדי לעקוף מגבלה זו, מדענים נקטו באמצעות מודלים מחלה כמו וירוס הכשל החיסוני סימיאן (SIV) ב קופי רזוס 4,5. למרבה הצער, יש מגבלות עיקריות במודל זה בשל ההבדלים האינהרנטיים בין זנים ואת ההבדלים בין SIV ו- HIV. בנוסף, רק מאוד מתקנים מיוחדים הם גapable לתמוך עבודה עם פרימטים לא אנושיים וכל מקוק דורשת השקעה גדולה. לפיכך, יש צורך דחוף מודל זה מנצל את מערכת החיסון האנושית, אשר רגישה זיהום HIV / בפתוגנזה, והוא פחות כלכלי מונע.
המגזר השקלי הלא צמוד שמנים סוכרתית (NOD) -severe immunodeficient משולב (SCID) בנוקאאוט שרשרת גמא -common (ג γ – / -) (או NSG) דם / כבד / קורנית (BLT) במודל העכבר האנושי הוכח ויותר להיות כלי חשוב ללמוד הידבקות ב- HIV. ידי השתלת תאי גזע hematopoietic (HSCs) ו התימוס העוברית, העכברים מסוגלים לפתח לשחזר מערכת חיסון אנושית 1-3. סוג אחד של ריפוי גנטי מבוסס תאי גזע כרוך 'הפניית' תאי T היקפי למקד HIV על ידי תכנות מחדש בתאי גזע hematopoietic (HSCs) להתמיין לתאי T אנטיגן ספציפי. הראינו בעבר כי HSCs הנדסה עם מחדש T תאים ספציפיים מולקולרית משובטים נגד HIVceptor (TCR) נגד אפיטופ SL9 (חומצת אמינו 77-85; SLYNTVATL) של HIV-1 Gag יכול להפנות תאי גזע לתוך להרכיב תאי הבוגרים T מדכאים תרבות נגיף ה- HIV במודל עכבר NSG-BLT האנושי 6. האזהרה של שימוש TCR מולקולרית משובטת היא שזה מוגבל אנטיגן לויקוציטים אנושי ספציפי (HLA) תת סוג כי יגביל את היישום של טיפול זה. קולטנים אנטיגן Chimeric (CAR), מצד שני, יכול להיות מיושם אוניברסלית לכל תת HLA. מחקרים ראשוניים בוצעו ניצול מכונית נבנתה עם התחומים התאיים ו הטרנסממברני של CD4 האדם התמזג ζ איתות תאיים מושלם של CD3 (שמכונה CD4ζCAR). CD4ζCAR הביע על תאי CD8 T יכול לזהות מעטפת HIV ו לעורר תגובת תא T ציטוטוקסיים כי הוא דומה לזה מתווך על ידי קולטן תא T 7. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי HSCs אדם יכול להיות שונה עם CD4ζCAR, אז מה שיכול להתמיין li hematopoietic המרובהneages, כולל תא פונקציונלי T מסוגל לדכאה שכפול HIV במודל העכבר האנושי 8. עם ההתקדמות המהירה טיפולים הקולטן לאנטיגן כימרי לסרטן 9, ואת האפיון המתמשך של נוגדנים מנטרלים רחבים חזקים 10-12 נגד HIV המאפשר בניית מכוניות נוגדני שרשרת אחת, זה נתפש שרבים בונים מועמד חדש, בנוסף CD4ζCAR , יופק ונבדקו על ריפוי גנטי מבוסס תאי גזע במחלות איידס ומחלות אחרות. בנוסף, במודל עכבר NSG-BLT האנושי המכיל מכוניות אנטיגן ספציפי אלה יכול גם לספק כלי שימושי לבדיקת תגובות תא T אנושיות מקרוב in vivo. חשוב לציין, הפרוטוקול שלנו נבדל שיטות שתוארו קודם לבניית מואנשים של עכברי BLT 13-15 בכך HSCs ב תערובת חלבונים דביקה משמש במקום הגזעי בכבד עובר 16. פרוטוקול זה מתאר: 1) בניית והרוחעכברי BLT zed מהונדסים עם CD4ζCAR; ו -2) אפיון של בידול של תאים מהונדסים גנטית; ו -3) אפיון של פונקציונליות של תאים מהונדסים גנטית.
עם מכונית ואת מומנטום צובר חסין מהונדסים מבוסס HSC כלפי מחקרים קליניים, חשוב להיות מודל חיה ראוי לבחון מקרוב את הבידול ותפקוד של תאים המהונדסים אלה. בפרוטוקול זה תארנו את השיטות לבנייה ובדיקת עכברים אנושיים עם תאי גזע מהונדסים גנטי המהונדסים נגד HIV. חשוב יש התמרה יעילה…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |