ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
HIVに対する幹細胞ベースの遺伝子治療の急速な発展に伴い、造血分化と遺伝的に修飾された細胞の免疫機能を研究するための動物モデルの差し迫った必要性があります。ヒト骨髄/肝臓/胸腺（BLT）マウスモデルは、T細胞、B細胞、NK細胞および単球を含む末梢におけるヒト免疫系の完全な再構成を可能にします。人間の胸腺インプラントはまた、自家胸腺組織におけるT細胞の胸腺選択を可能にします。 HIV感染の研究に加えて、モデルは、造血幹細胞（HSC）に由来する細胞の分化、発達と機能を研究するための強力なツールとして立っています。ここでは、ヒト化非肥満糖尿病（NOD）の建設を概説複合免疫不全（SCID）-commonガンマ鎖ノックアウト（Cγ – / – ）-severe HSCを形質導入と-Bone骨髄/肝臓/胸腺（NSG-BLT）マウスをCD4キメラ抗原受容体（CD4CAR）とレンチウイルスベクター。我々はCD4CAR HSCが正常に複数の系統に分化し、抗HIV活性を有することができることを示します。研究の目的は、HIVに対する工学的免疫のためのin vivoモデルとしてNSG-BLTマウスモデルの使用を実証することです。それは、レンチウイルスとヒト組織を用いているため、実験や手術は、特別な予防措置（BSL2 +）の施設でバイオセーフティレベル2（BSL2）でクラスII安全キャビネット内で行うべきである、ということは注目に値します。
Introduction
組み合わせ抗レトロウイルス療法の成功にもかかわらず、HIV感染は依然として生涯疾患です。 HIVに対する細胞性免疫応答は、HIVの複製を制御するのに非常に重要な役割を果たしています。幹細胞操作の最近の進歩は、HIV治療1-3ための遺伝子治療アプローチの迅速な開発を可能にしました。その結果、HIVに対する細胞ベースの治療の有効性のインビボ研究において可能適切な動物モデルを有することが重要です。
動物モデルにおいてHIVの操作ウイルスが唯一のヒトの細胞に感染しているという事実によって複雑になります。この制限を回避するために、科学者は、アカゲザル4,5にサル免疫不全ウイルス（SIV）などの疾患モデルを使用することに頼っています。残念ながら、種間の固有の違いやSIVとHIVの間の違いにこのモデルの主要な制限があります。また、唯一の専門性の高い施設は、cですヒト以外の霊長類での作業を支援するapable、各マカクは、大規模な投資が必要。従って、HIV感染/発症に対して感受性であるヒト免疫系を利用し、より少ない財政法外であるモデルの差し迫った必要性があります。
非肥満糖尿病（NOD）-severe複合免疫不全（SCID）-commonガンマ鎖ノックアウト（Cγ – / – ）（またはNSG）血液/肝臓/胸腺（BLT）ヒト化マウスモデルますます重要なツールであることが証明されていますHIV感染を研究します。造血幹細胞（HSC）および胎児胸腺を移植することにより、マウスが開発し、ヒトの免疫系1-3を再現することができます。幹細胞ベースの遺伝子治療の一つのタイプは、抗原特異的T細胞に分化する造血幹細胞（HSC）を再プログラミングすることによってHIVを標的とするために、末梢T細胞を「リダイレクト」することを含みます。我々は以前に示した、分子クローニングされた抗HIV特異的T細胞の再と工学のHSCSL9エピトープ（アミノ酸77-85; SLYNTVATL）に対する受容体（TCR）は、HIV-1のGagは、ヒト化NSG-BLTマウスモデル6におけるHIVの複製を抑制する成熟T細胞の形成に幹細胞をリダイレクトすることができます。分子クローン化TCRを使用する注意点は、それがこの治療の適用を制限する特定のヒト白血球抗原（HLA）のサブタイプに制限されることです。キメラ抗原受容体（CAR）、一方、普遍すべてのHLAサブタイプに適用することができます。初期の研究は、CD3のドメインを細胞内シグナル伝達ζに融合されたヒトCD4の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインで構成CARを利用して実施された（CD4ζCARと呼ばれます）。 CD4ζCARは、HIVエンベロープを認識し、T細胞受容体7によって媒介されるものと同様である細胞傷害性T細胞応答を誘発することができるCD8 T細胞上に発現しました。我々は最近、ヒトHSCは、複数の造血リーに分化することができるCD4ζCARで修飾することができることを実証しましたヒト化マウスモデル8においてHIV複製を抑制することができる機能的なT細胞を含むneages。癌9ためのキメラ抗原受容体療法、および一本鎖抗体車の構築を可能にする、HIVに対する強力な幅広い中和抗体10-12の継続的な特徴付けの急速な進歩により、それはCD4ζCARに加えて、知覚、多くの新たな候補構築物であります、生成され、HIV疾患および他の疾患の幹細胞ベースの遺伝子治療のためにテストされます。また、これらの抗原特異的な自動車を含むヒト化NSG-BLTマウスモデルはまた、密接に、インビボでのヒトT細胞応答を調べるために有用なツールを提供することができます。ゼラチン状タンパク質混合物中の造血幹細胞が胎児肝幹16の代わりに使用されているという点で重要なことは、我々のプロトコルは、13-15 BLTマウスのヒト化構築のための以前に記載された方法とは異なります。このプロトコルは、説明しますhumaniの1）建設CD4ζCARで操作ZED BLTマウス。 2）遺伝的に改変された細胞の分化の特徴を、 3）遺伝的に改変された細胞の機能性の特徴付けを。
Protocol
Representative Results
Discussion
CARおよびHSCベースに設計免疫が臨床研究に向けて勢いを増しと、密接にこれらの操作された細胞の分化と機能を調べるために、適切な動物モデルを有することが重要です。このプロトコルでは、HIVに対する工学的遺伝的に改変された幹細胞とヒト化マウスを構築し、テストするための方法を説明しました。移植の前に、幹細胞の効率的な形質導入を有することが重要です。しかしながら、標…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
Referencias
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