This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
HIV'e karşı kök hücreye dayalı gen terapisi hızlı gelişimi ile, genetik olarak tadil edilmiş hücrelerin hematopoietik farklılaşmasını ve bağışıklık fonksiyonu incelemek için bir hayvan modeli için gereksinimi basarak vardır. İnsanlaştırılmış kemik iliği / Karaciğer / Timus (BLT) fare modeli T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monositler dahil çevrede, bir insan bağışıklık sistemi tam sulandırma sağlar. insan timus implant, aynı zamanda, otolog timik dokuda T hücrelerinin timus seçimine izin verir. HIV enfeksiyonu çalışma ek olarak, model, hematopoietik kök hücreler (HSC), elde edilen hücrelerin farklılaşması, geliştirme ve özelliğe araştırmak için güçlü bir araç konumundadır. Kalıt HSCler ile -Bone iliği / Karaciğer / Timus (NTG-BLT) fareler ile Burada kombine bağışıklık eksikliği olan (SCID) -Ortak gama zinciri nakavt – (- / C γ) -severe insanlaştırılmış obez olmayan diyabetik (NOD) yapımına özetlemektedir CD4 kimerik antijen reseptörü ile (CD4CAR)lentivirüs vektör. Bu CD4CAR HSC başarıyla birden fazla soy dönüştürmek ve anti-HIV etkinliğe sahip olduğunu göstermektedir. Çalışmanın amacı, HIV'e karşı tasarlanmış bağışıklık için bir in vivo modeli olarak NTG-blt fare modelinde kullanımını göstermektir. Bu lentivirüs ve insan dokusu kullanıldığı için, deneyler ve ameliyatlar özel önlemler (BSL2 +) tesisi ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) bir Sınıf II biyogüvenlik kabini yapılmalıdır, dikkati çekiyor.
Kombine antiretroviral tedavinin başarısına rağmen, HIV enfeksiyonu hala hayat boyu bir hastalıktır. HIV'e karşı hücresel immün yanıt HIV çoğalmasını kontrol etmede oldukça önemli bir rol oynamaktadır. Kök hücre manipülasyonu son gelişmeler HIV tedavisi 1-3 yaklaşımlar gen tedavisinin hızlı gelişimi için izin vermektedir. Bunun bir sonucu olarak, HIV'e karşı hücre bazlı terapilerin etkinliğinin in vivo çalışmada sağlayan bir uygun hayvan modeli olması önemlidir.
hayvan modellerinde HIV ile çalışan virüs sadece insan hücreleri enfekte olduğu gerçeği ile karmaşık. Bu sınırlama aşmak için, bilim adamları Rhesus makak 4,5 yılında Simian İmmün Yetmezlik Virüsü (SIV) gibi hastalık modelleri kullanarak başvurdular. Ne yazık ki, türler arasında doğal farklılıklar ve SIV ve HIV arasındaki farklılıklar, bu modelde temel sınırlamalar vardır. Buna ek olarak, sadece son derece uzmanlaşmış tesisleri c vardırinsan olmayan primatlar ve her makak ile çalışmalarını destekleme apable büyük bir yatırım gerektirir. Böylece, HIV enfeksiyonu / patogenezi duyarlı insan bağışıklık sistemini kullanır ve daha az mali yasaklayıcı bir model için acil bir ihtiyaç vardır.
(Ya da NTG) Kan / Karaciğer / Thymus (BLT) insanlaştırılmış fare modeli giderek olduğu kanıtlanmıştır önemli bir araç obez olmayan diyabetik (NOD) kombine immün yetmezliği olan (SCID) -ortak gama zinciri nakavt – (- / c γ) -severe HIV enfeksiyonunu incelemek için. Hematopoetik kök hücreleri (HKH'lerin) ve fetal timus implante ederek, fareler geliştirmek ve insan bağışıklık sistemini 1-3 recapitulate edebiliyoruz. kök hücre bazlı gen terapisinin bir tipi, antijene özel T hücreleri ayırt etmek Hematopoietik kök hücreler (HSC), yeniden programlayarak HIV hedef periferik T hücrelerinin yönlendirme 'içerir. Daha önce göstermiştir ki, bir molekül klonlanmış bir anti-HIV spesifik T hücresi yeniden mühendislik HSCSL9 epitopa (amino asit 77-85; SLYNTVATL) karşı reseptör (TCR), HIV-1 Gag hümanize NTG-blt fare modelinde 6 HIV kopyalanmasını bastırdığı Olgun T hücreleri oluşturan kök hücre yeniden yönlendirebilir. molekül klonlanmış TCR kullanılarak ikaz bu tedavinin uygulanmasını sınırlar, belirli bir insan lökosit antijeni (HLA) alt tipi ile sınırlı olmasıdır. Kimerik antijen reseptörleri (CAR), diğer taraftan, evrensel olarak tüm HLA alt tiplerinin uygulanabilir. İlk çalışmalar CD3 alan sinyal hücre içi ζ birleştirilmiş insan CD4, hücre dışı ve transmembran ile inşa bir araba kullanılarak yapıldı (CD4ζCAR olarak da adlandırılır). CD4ζCAR HIV zarf tanır ve bir T hücresi reseptörü tarafından aracılık edilen 7 edilene benzer bir sitotoksik T hücre yanıtını tetikleyen CD8 T hücreleri üzerinde ifade edilmiştir. Biz son zamanlarda insan HKH'lerin sonra birden hematopoetik li içine ayırt edebilirsiniz CD4ζCAR ile modifiye edilebilir olduğunu göstermiştirinsanlaştırılmış fare modelinde 8 HIV replikasyonunu bastırma yeteneğine sahip fonksiyonel T hücreleri de dahil olmak üzere neages. Kanser 9 kimerik antijen reseptör terapileri hızlı ilerlemesi ve güçlü geniş nötralize antikorları tek zincirli antikor SYR'lerinden inşaatına izin HIV'e karşı 10-12 sürekli karakterizasyonu ile, algılanabilir CD4ζCAR yanı sıra pek çok yeni aday yapıları olduğunu oluşturulan ve HIV hastalıklar ve diğer hastalıkların kök hücre bazlı gen terapisi için test edilecektir. Buna ek olarak, bu antijene özgü kabinli insanlaştırılmış NTG-blt fare modeli de yakından in vivo olarak insan T hücresi yanıtlarını incelemek için yararlı bir araç sağlayabilir. Önemli olarak, protokol BLT fareler, HSC jelatinimsi protein karışımı fetal karaciğer gövdeleri 16 yerine kullanılır 13-15 hümanize yapımı için bir önceki açıklanan yöntemlere farklıdır. Bu protokol açıklar: humani 1) inşaatıCD4ζCAR ile mühendislik zed BLT fareler; ve 2) genetiği değiştirilmiş hücrelerin farklılaşma karakterizasyonu; genetik olarak tadil edilmiş hücrelerin işlevselliği ve 3) karakterizasyonu.
CAR ve klinik çalışmalarda doğru HSC tabanlı mühendislik bağışıklık kazanıyor ivme ile, yakından bu mühendislik hücrelerin farklılaşması ve işlevini incelemek için uygun bir hayvan modeli olması önemlidir. Bu protokolde inşa ve HIV'e karşı tasarlanmış genetiği değiştirilmiş kök hücrelerle hümanize fareler test edilmesi için yöntemler tarif. Nakli öncesinde kök hücrelerin etkin transdüksiyonunu olması önemlidir. Bununla birlikte, hedef hücrelerin tanınması üzerine çoğal…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |