Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Patch-Clamp-Studien von Dorsalwurzelganglien (DRGs) Neuronen haben unser Verständnis des peripheren Nervensystems erhöht. Derzeit sind die meisten Aufzeichnungen auf dissoziierten DRG Neuronen durchgeführt, die ein Standardpräparat für die meisten Laboratorien ist. Neuronal Eigenschaften können jedoch durch axonalen Schädigung geändert werden, die durch Enzymverdauung verwendet in dissoziierten Neuronen zu erwerben. Weiterhin kann distanzierte Neuron Präparate nicht vollständig die Mikroumgebung der DRG dar, da Kontaktverlust mit Satelliten-Glia-Zellen, die die primären sensorischen Neuronen ist eine unvermeidliche Folge dieses Verfahrens umgeben. Um die Einschränkungen bei der Verwendung herkömmlicher distanzierte DRG – Neuronen für Patch – Clamp – Aufnahmen zu überwinden, die in diesem Bericht beschreiben wir eine Methode , um intakte DRGs vorzubereiten und Patch – Clamp – Aufnahmen auf einzelnen primären sensorischen Neuronen ex vivo durchzuführen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und unkomplizierte Herstellung von intakten DRGs, imitiert devivo – Bedingungen von DRG – Neuronen im Zusammenhang mit der sie umgebenden Satelliten Gliazellen und Basalmembran zu halten. Weiterhin vermeidet das Verfahren vor Manipulation axonale Verletzung und Enzymverdau wie bei DRGs dissoziierenden. Diese ex vivo Herstellung kann zusätzlich verwendet werden , um die Interaktion zwischen primären sensorischen Neuronen und Satelliten – Gliazellen zu studieren.
Introduction
Sensation ist von wesentlicher Bedeutung für einen Organismus für das Überleben und Wohlbefinden. Die Übertragung der Impulse ist abhängig von der sensorischen Bahnen an peripheren Enden der Axone von primären sensorischen Neuronen beginnen. Primären sensorischen Neuronen, mit Ausnahme des Nucleus mesencephalicus des Trigeminus, sind in der Trigeminalganglien und Dorsalwurzelganglien (DRGs) gelegen. Sie dienen als Torwächter der sensorischen Informationen 1. Am perikarial Membran, wie in den zentralen und peripheren Terminals, exprimieren DRG Neuronen Rezeptoren und Ionenkanäle, wie Glutamat – Rezeptoren, TNF alpha – Rezeptoren transient receptor potential Kationenkanal – Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), Natriumkanäle, etc. 2 -7. Patch-Clamp-Aufnahmen der perikarial Membran erlauben Verständnis funktionelle Veränderungen vieler dieser Rezeptoren und Kanäle während des Neurons.
Die Patch-Clamp-Aufnahmetechnik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für studie Aktivitäten der Kanäle oder Rezeptoren , und eine große Anzahl von Studien haben zu sterben durch die Anwendung dieser Technik auf DRG – Neuronen 8-10 durchgeführt. In den meisten Studien wird die DRG durch Schneiden der dorsalen Würzelchen und Spinalnerven der Nähe des Ganglion entfernt. Nach dem Zerkleinern wird das Ganglion dann in Verdauungsenzyme gelegt, die in Dissoziation der DRG-Neuronen führen, die dann sofort aufgezeichnet werden können oder kultiviert für mehrere Tage vor der Aufzeichnung. Leider beinhaltet die Dissoziation von DRG-Neuronen eine notwendige Axotomie der Nähe des Perikarya. Sobald dissoziiert und axotomisierten unterliegen DRG Neuronen phänotypischen Veränderungen sowie Änderungen in Membran Erregbarkeit 11,12. Der Kontaktverlust zwischen dem Perikarya von einzelnen Neuronen und die Satelliten Gliazellen , die normalerweise sie umgeben ist wahrscheinlich auf diese Veränderungen 13 beizutragen. Das Übersprechen zwischen den Neuronen und Gliazellen Satelliten ist sowohl wesentlich unter physiologischen Bedingungen und in Anpassung an Pathologschen Bedingungen , wie sie auf hartnäckigen Schmerzen 14,15 führen. Es wäre eine Herausforderung, die Interaktion zwischen den Neuronen und Satelliten-Gliazellen zu studieren, um ein dissoziierten DRG Vorbereitung.
Intact DRGs, andererseits bieten näher an in vivo – Bedingungen. In den vergangenen Jahren hat sich unser Labor, sowie einige andere Gruppen, hat sich von erwachsenen Ratten intakt DRGs wurden unter Verwendung von Änderungen der primären sensorischen Neuronen unter verschiedenen Bedingungen mit chronischen Schmerzen 3-5,11,15-17 assoziiert zu untersuchen. Obwohl die in diesen Studien verwendeten Techniken etwas etabliert sind, ein Schritt-für-Schritt-Beschreibung noch nicht veröffentlicht wurde. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir eine bequeme und schnelle Art und Weise intakt DRGs und ihre Verwendung für Patch-Clamp-Aufnahmen vorzubereiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichten über eine Methode, um ganze DRGs für die Patch-Clamp-Studien vorzubereiten. Es gibt mehrere wichtige Elemente für eine ideale Probe vorbereitet. Erstens ist es wichtig, die DRGs mit dorsalen Wurzeln angebracht zu sezieren. Danach müssen die Epineurium sorgfältig entfernt werden, während eine Beschädigung der Neuronen zu vermeiden. Schließlich freizulegen, die Neuronen und deren umgebenden Satelliten Gliazellen, ist es notwendig, die verbleibende Bindegewebe zu verdauen. Intakte DRGs von erwachsenen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
Referencias
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