Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
estudos de patch-clamp de gânglios da raiz dorsal (DRGs) neurônios têm aumentado nossa compreensão do sistema nervoso periférico. Actualmente, a maioria das gravações são realizadas sobre os neurónios DRG dissociados, que é uma preparação padrão para a maioria dos laboratórios. propriedades neuronais, no entanto, pode ser alterada por lesão axonal resultante da digestão com enzimas utilizadas na aquisição de neurónios dissociados. Além disso, as preparações neuronais dissociadas não pode representar plenamente o microambiente do DRG desde perda de contacto com células gliais por satélite que rodeiam os neurônios sensoriais primários é uma conseqüência inevitável desse método. Para superar as limitações no uso de neurônios DRG dissociados convencionais para gravações de patch clamp, neste relatório nós descrevemos um método para preparar DRGs intactas e realizar gravações patch clamp em neurônios sensoriais primários individuais ex vivo. Esta abordagem permite a preparação rápida e simples das DRGs intactos, imitando emvivo condições de manter os neurônios DRG relacionadas com as suas células gliais por satélite em volta e membrana basal. Além disso, o método evita a lesão axonal de manipulação e de digestão enzimática, tais como quando se dissociar DRGs. Esta preparação ex vivo pode, adicionalmente, ser utilizado para estudar a interacção entre os neurónios sensoriais primários e células gliais por satélite.
Introduction
Sensation é essencial para a sobrevivência e bem-estar de um organismo. A transmissão de estímulos é dependente das vias sensoriais a partir de terminações periféricas dos axónios de neurónios sensoriais primários. neurónios sensoriais primários, com a excepção de o núcleo mesencefálico do nervo trigeminal, situam-se nos gânglios da raiz dorsal e gânglios trigeminais (DRG). Eles servem como guardiões da informação sensorial 1. Na membrana perikarial, assim como nos terminais centrais e periféricos, os neurônios DRG expressam receptores e canais iônicos, tais como receptores de glutamato, os receptores alfa de TNF, receptor de potencial transitório canal cátion membro da subfamília V 1 (TRPV1), canais de sódio, etc. 2 -7. gravações de patch clamp da membrana perikarial permitir compreender alterações funcionais de muitos destes receptores e canais ao longo do neurónio.
A técnica de gravação de patch-clamp é uma ferramenta poderosa para stumorrendo as actividades dos canais ou receptores e um grande número de estudos foram realizados por aplicação da presente técnica em neurónios DRG 8-10. Na maioria dos estudos, o DRG é removido através do corte das radículas dorsais e nervo perto da coluna vertebral para o gânglio. Após a trituração, o gânglio é, então, colocado em enzimas digestivas que resultam na dissociação dos neurónios DRG, que podem então ser gravados imediatamente ou cultivadas durante vários dias antes da gravação. Infelizmente, a dissociação dos neurônios DRG envolve uma axotomia necessário perto do pericários. Uma vez dissociados e axotomia, os neurônios DRG sofrer alterações fenotípicas, bem como alterações na excitabilidade da membrana 11,12. A perda de contato entre o pericários de neurônios individuais e as células gliais por satélite que normalmente cercam deles é susceptível de contribuir para estas mudanças 13. O crosstalk entre os neurônios e células gliais por satélite é tanto essencial em condições fisiológicas e na adaptação às pathologcondições políticas, tais como as que podem causar dor intratável 14,15. Seria um desafio para estudar a interação entre os neurônios e células gliais por satélite usando uma preparação DRG dissociada.
DRGs intacto, por outro lado, fornecer aproximar das condições in vivo. Nos últimos anos, nosso laboratório, bem como alguns outros grupos, tem vindo a utilizar DRGs intactas de ratos adultos para investigar mudanças de neurônios sensoriais primários em diferentes condições associadas com dor crônica 3-5,11,15-17. Embora as técnicas utilizadas nestes estudos são relativamente estabelecido, uma descrição passo-a-passo não foi ainda publicada. No presente artigo, são apresentadas uma maneira conveniente e rápido para preparar DRGs intactas e sua utilização para gravações patch clamp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós relatamos um método para preparar DRGs inteiros para estudos patch clamp. Há vários elementos-chave para a preparação de um espécime ideais. Em primeiro lugar, é importante para dissecar os DRGs com raízes dorsais anexados. Depois disso, o perineuro necessitam de ser cuidadosamente removidas, evitando danos para os neurónios. Finalmente, para expor os neurónios e as suas células gliais circundantes por satélite, que é necessário para digerir o tecido conjuntivo restante. DRGs intactas a partir de rato…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
Referencias
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neurociencias. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
