Патч зажим Recordings на неповрежденном спинальных ганглиях от взрослых крыс
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Патч зажим исследования от спинальных ганглиях (КСГ) нейронов увеличили наше понимание периферической нервной системы. В настоящее время большинство записей проводятся на диссоциированных нейронов DRG, который является стандартным для большинства подготовка лабораторий. Нейронные свойства, однако, может быть изменена путем аксонального повреждения в результате ферментативного расщепления, используемой в получении диссоциированных нейронов. Кроме того, диссоциированные нейронные препараты не могут в полной мере представляет микроокружение DRG, так как потеря контакта с спутника глиальных клеток, которые окружают первичные сенсорных нейронов является неизбежным следствием этого метода. Чтобы преодолеть ограничения в использовании обычных диссоциированных нейронов DRG для патч зажим записи, в настоящем докладе мы опишем метод , чтобы подготовить нетронутыми ДРГ и провести патч зажим записи на отдельных первичных сенсорных нейронов бывших естественных условиях. Такой подход позволяет быстро и прямой получение неповрежденных КСГ, имитируя вVivo условия путем поддержания DRG нейроны , связанные с окружающими их спутника глиальных клеток и базальной мембраны. Кроме того, способ позволяет избежать аксонального повреждения от манипуляций и ферментативному перевариванию, например, когда диссоциирует ДРГ. Этот препарат ех естественных условиях дополнительно может быть использован для изучения взаимодействия между первичными сенсорными нейронами и спутниковых глиальных клеток.
Introduction
Ощущение имеет важное значение для выживания организма и хорошего самочувствия. Передача раздражителей зависит от сенсорных путей, начинающихся в периферических окончаниях аксонов из первичных сенсорных нейронов. Первичные сенсорные нейроны, за исключением среднего мозга ядра тройничного нерва, расположены в тройничного ганглиев и ганглиях задних корешков (DRG,). Они служат в качестве хранителей сенсорной информации 1. На perikarial мембране, так же , как в центральных и периферийных терминалов, DRG нейроны экспрессируют рецепторы и ионные каналы, такие как глутаматных рецепторов, TNF альфа – рецепторов, преходящие потенциал рецепторов катиона канала подсемейства V члена 1 (TRPV1), натриевые каналы и т.д. 2 -7. Зажим записи патч этого perikarial мембраны позволяют понять функциональные изменения многих из этих рецепторов и каналов по всему нейрону.
Метод записи патч зажим является мощным инструментом для СТЮумирающих деятельность каналов или рецепторов , а также большое количество исследований было проведено с применением этой техники на DRG нейроны 8-10. В большинстве исследованиях DRG удаляется путем разрезания спинных корешков и спинного нерва близко к ганглии. После того, как мясорубки, ганглий затем помещают в пищеварительные ферменты, которые приводят к диссоциации нейронов DRG, которые затем могут быть записаны непосредственно или культивируют в течение нескольких дней до начала записи. К сожалению, диссоциация нейронов DRG включает в себя необходимую аксотомии близко к perikarya. После того, как диссоциирует и аксотомизированных, DRG нейроны подвергаются фенотипические изменения, а также изменения в мембранной возбудимости 11,12. Потеря контакта между perikarya отдельных нейронов и спутниковых глиальных клеток , которые обычно окружают их, скорее всего , внести свой вклад в эти изменения 13. Перекрестные помехи между нейронами и глиальных клеток спутника является одновременно существенным в физиологических условиях и в адаптации к pathologческие условия , такие как те , что приводит к неразрешимой боли 14,15. Было бы сложно изучить взаимодействие между нейронами и спутниковых глиальных клеток с использованием диссоциированного препарата DRG.
Интактные DRGs, с другой стороны, обеспечивают ближе к условиям , в естественных условиях. За последние несколько лет наша лаборатория, а также некоторые другие группы, использует неповрежденные ДРГ от взрослых крыс , чтобы исследовать изменения первичных сенсорных нейронов в различных состояниях , связанных с хронической болью 3-5,11,15-17. Хотя методы, используемые в этих исследованиях несколько установлено, описание шаг за шагом до сих пор не опубликованы. В данной рукописи, мы описываем удобный и быстрый способ подготовить нетронутыми ДРГ и их применение для патч зажим записи.
Protocol
Representative Results
Discussion
We report a method to prepare whole DRGs for patch clamp studies. There are several key elements for preparing an ideal specimen. Firstly, it is important to dissect the DRGs with dorsal roots attached. After that, the epineurium need to be carefully removed while avoiding damage to the neurons. Finally, to expose the neurons and their surrounding satellite glial cells, it is necessary to digest the remaining connective tissue. Intact DRGs from adult rats prepared with the method described here will maintain good viabili…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
Referencias
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neurociencias. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
