Een protocol voor de bereiding en karakterisering van lipofiele doxorubicine pro-geneesmiddel beladen 1,2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanolamine- N – [amino (polyethyleenglycol) -2000] (DSPE-PEG) micellen wordt beschreven.
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Chemotherapie wordt vaak gebruikt om diverse vormen van kanker te behandelen. De meeste, zo niet alle, chemotherapie drugs hebben toxische bijwerkingen die kunnen variëren van kleine beheersbare omstandigheden zoals misselijkheid en diarree, meer levensbedreigende aandoeningen. Omdat de meeste antikankergeneesmiddelen zijn giftig, niet-selectieve blootstelling van deze geneesmiddelen met normaal weefsel onvermijdelijk een toxiciteit. Daarom is er een grote behoefte aan een therapeutische benadering die selectief geneesmiddelen kan leveren in kankercellen. Een andere uitdaging met de toediening van geneesmiddelen tegen kanker is hun slechte oplosbaarheid in water. Gewoonlijk worden oplosbaarmakende middelen nodig om deze slecht oplosbare geneesmiddelen te formuleren. Evenwel meeste solubiliserende middelen, zoals dimethylsulfoxide (DMSO), Cremophor EL en Polysorbaat 80 (Tween 80) lever- en niertoxiciteit, hemolyse, acute overgevoeligheidsreacties en perifere neuropathieën Daarom veroorzaken. 1, zijn veilige en biocompatibele samenstellingen die nodig zijn voor het klinisch gebruik van slechtely oplosbare geneesmiddelen tegen kanker. Nanocarriers zijn veelbelovende drug delivery systemen voor de aanpak van de bovengenoemde uitdagingen. Deze nanocarriers omvatten liposomen, 2 nanodeeltjes, 3 micellen, 4-7 polymeer-drug conjugaten, 8 en anorganische materialen. 9 Verschillende nanomedicine producten (bv Doxil, Abraxane en Genexol) zijn goedgekeurd door de regelgevende agentschappen goedgekeurd voor de behandeling van kankerpatiënten. 10
Polymere micellen zijn veelbelovende nano-schaal drug delivery dragers, die met succes zijn gebruikt voor de levering van geneesmiddelen tegen kanker. 4-7,11,12 Typische polymere micellen worden bereid uit amfifiele polymeren door middel van een zelf-assemblage proces. De kern-schil gestructureerde polymere micellen omvatten een hydrofiele schaal en een hydrofobe kern. De hydrofiele dop kunnen sterisch stabiliseren micellen en verlengen hun circulatie in het bloed stream. De hydrofobe kern kan effectief kapselen hydrofobe dtapijten. Door de geringe omvang van micellen (typisch minder dan 200 nm) en de lange circulatie eigenschappen zijn polymere micellen aangenomen tumor targeting bereiken via verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect (passieve tumortargeting).
Geneesmiddelbelading stabiliteit is kritisch voor de tumor targeting vermogen van micellen. Optimale tumor targeting bereiken moeten micellen minimale drug lekkage alvorens de tumor, maar snel het geneesmiddel af te geven na het invoeren van kankercellen. Daarnaast formulering stabiliteit is een essentiële voorwaarde voor productontwikkeling, omdat formulering stabiliteit bepaalt de haalbaarheid van productontwikkeling, evenals de houdbaarheid van ontwikkelde producten. Onlangs heeft veel moeite gedaan om het laden van drugs te verbeteren in de levering dragers. Het lipofiele prodrug benadering is een strategie die is onderzocht om geneesmiddelbelading verbetering in lipidenanodeeltjes en emulsies. 13,14 de conjugation van lipiden met geneesmiddelen kan een aanzienlijke verbetering van hun lipofiliteit en versterken van het laden en retentie in de lipofiele componenten van nanocarriers.
We beschrijven hier een protocol voor het bereiden lipofiele doxorubicine pro-geneesmiddel beladen micellen. Eerst wordt de syntheseprocedure voor doxorubicine lipofiele prodrug beschreven. Vervolgens wordt een protocol voor het genereren van micellen met een film-dispersiewerkwijze geïntroduceerd. Deze werkwijze is met succes gebruikt in onze eerdere studies. 5 DSPE-PEG werd geselecteerd als dragermateriaal voor de bereiding micellen omdat het succes gebruikt voor micel geneesmiddelafgifte. 15,16 Tenslotte wij verschillende in vitro assays worden gebruikt om micellen te karakteriseren beschrijven formuleringen en antikanker activiteit te evalueren.
In dit werk beschrijven we een eenvoudige, snelle werkwijze film-dispersie voor de bereiding van micellen. Deze werkwijze gebruikt de zelfassemblage eigenschappen van een amfifiel polymeer (bijvoorbeeld PEG-DSPE) aan kern-mantel structuur micellen vormen in een waterige omgeving. Deze micellen bereidingswijze heeft verschillende voordelen. 1. Het gaat om een eenvoudige formulering proces dat het gebruik van ingewikkelde stappen verkleinen van de deeltjes (zoals extrusie of homogeniseren) gewoonlijk in de bereid…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |