פרוטוקול עבור ההכנה והאפיון של סמי פרו דוקסורוביצין lipophilic טעון 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N – [אמינו (פוליאתילן גליקול) -2000] (DSPE-PEG) מיצלות מתוארת.
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
כימותרפיה משמשת בדרך כלל לטיפול צורות שונות של סרטן. רוב, אם לא כל, תרופות כימותרפיות יש תופעות לוואי רעילות אשר עשוי להשתנות תנאים קלים לניהול, כגון בחילות ושלשולים, ליותר סכנת חיים בתנאים. מכיוון שרוב התרופות נגד הסרטן עלולות להיות רעילות, חשיפה הלא סלקטיבי של תרופות אלו רקמות בריאות בהכרח גורמת רעילה. לכן, יש צורך גדול עבור גישה טיפולית שיכול לספק תרופות באופן סלקטיבי לתוך תאים סרטניים. אתגר נוסף עם הממשל של תרופות נגד סרטן הוא מסיסות המים הירודה שלהם. בדרך כלל, סוכני solubilizing נדרשים לגבש גרוע תרופות אלו מסיסים. עם זאת, רוב סוכני solubilizing, כגון sulfoxide דימתיל (DMSO), Cremophor EL, ו polysorbate 80 (Tween 80) עלולים לגרום כבד רעיל בכליה, המוליזה, תגובות של רגישות יתר חריפת מחלות עצבים היקפיות. 1 לכן, ניסוחים בטוחים ביולוגיים נדרשים השימוש הקליני של ענייםתרופות נגד סרטן מסיסים ly. Nanocarriers מבטיח מערכות אספקת סמים עבור בהתמודדות עם האתגרים הנ"ל. Nanocarriers אלה כוללים ליפוזומים, 2 חלקיקים, 3 מיצלות, 4-7 conjugates פולימר-סמים, 8 וחומרים אורגניים. 9 מוצרים ננו-רפואה אחדים (למשל, Doxil, Abraxane, ו Genexol) אושרו על ידי רשויות רגולטוריות לטיפול בחולי סרטן. 10
מיצלות פולימרית מבטיחה נושאות משלוח סמים בקנה מידת ננו, אשר שמשו בהצלחה עבור המשלוח של תרופות נגד סרטן. 4-7,11,12 מיצלות פולימריים אופייניים ערוכות פולימרי amphiphilic באמצעות תהליך הרכבה עצמית. מיצלות פולימריים המובנהיות-פגז הליבה כוללות פגז הידרופילי ליבה הידרופובי. הפגז הידרופילי יכול sterically לייצב מיצלות ולהאריך הפצתם בזרם הדם. ליבת הידרופובי יכול לתמצת ד הידרופובי ביעילותשטיחים. בגלל גודלו הקטן של מיצלות (בדרך כלל פחות מ 200 ננומטר) ומאפיינים ארוך מחזור, מיצלות פולימריים הם האמינו להשיג גידול מיקוד באמצעות חדירות משופרות ואפקטי שמירה (EPR) (גידול פסיבי מיקוד).
יציבות טעינה ותרופות היא קריטית עבור גידול מיקוד היכולת של מיצלות. כדי לבצע מיקוד גידול אופטימלי, צריכה מיצלות דליפת תרופה מינימאלית לפני שהגיע לאזור הגידול, עדיין במהירות לשחרר את התרופה לאחר הזנת תאים סרטניים. בנוסף, יציבות ניסוח היא גם תנאים הכרחיים לפיתוח מוצר, כי יציבות ניסוח מקובעת את הכדאיות של פיתוח מוצר, כמו גם את חיי המדף של מוצרים שפותחו. לאחרונה, הרבה מאמץ נעשה כדי לשפר את הטעינה של תרופות לתוך ספקי משלוח. הגישה הפרו-סמי lipophilic היא אסטרטגיה אשר נחקרה לשפר טעינת סמים לתוך חלקיקי שומני תחליבים. 13,14 conjugation של ליפידים עם תרופות יכול לשפר lipophilicity שלהם באופן משמעותי ולשפר את טעינת ושימור במרכיבי lipophilic של nanocarriers.
כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מיצלות פרו-סמים טעונים דוקסורוביצין lipophilic. ראשית, הליך סינתזה עבור doxorubicin פרו-סמים lipophilic מתואר. לאחר מכן, פרוטוקול להפקת מיצלות עם שיטת דוחי סרט הוא הציג. שיטה זו שימש בהצלחה במחקרים קודמים שלנו. 5 DSPE-PEG נבחרה כחומר המוביל להכנת מיצלות כי זה שימש בהצלחה עבור משלוח הסמים micelle. 15,16 לבסוף, אנו מתארים מספר מבחני חוץ גופית להשתמש בהם כדי לאפיין micelle פורמולציות להעריך פעילות אנטי-סרטנית.
בעבודה זו, אנו מתארים שיטת פיזור סרט מסובכת, מהירה לעריכת מיצלות. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה עצמית של פולימר amphiphilic (למשל, DSPE-PEG) כדי ליצור מיצלות הליבה-פגז מובנה בסביבה מימית. יש שיטת הכנת micelle זו מספר יתרונות. 1. זה כרוך בתהליך ניסוח פשוט, אשר ימנע את השימוש של צעד…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |