Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen
Summary
Ein Protokoll für die Herstellung und Charakterisierung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladen 1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N – [Amino (Polyethylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) Micellen beschrieben.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
Chemotherapie wird häufig verwendet, um verschiedene Formen von Krebs zu behandeln. Die meisten, wenn nicht alle, chemotherapeutische Medikamente haben toxische Nebenwirkungen, die von handhabbaren minor Bedingungen, wie Übelkeit und Diarrhö, um mehr lebensbedrohlichen Zuständen variieren kann. Da die meisten Krebsmedikamente toxisch, nicht-selektive Belichtung dieser Medikamente zu normalem Gewebe sind verursacht unweigerlich Toxizität. Daher besteht ein großer Bedarf für einen therapeutischen Ansatz, der selektiv Drogen in Krebszellen liefern kann. Eine weitere Herausforderung bei der Verabreichung von Anti-Krebs-Medikamente ist ihre schlechte Wasserlöslichkeit. Üblicherweise werden Solubilisierungsmittel notwendig, um diese schlecht löslichen Arzneimitteln zu formulieren. Allerdings sind die meisten Lösungsvermittlern, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Cremophor EL, und Polysorbat 80 (Tween 80) kann zu Leber- und Nierentoxizität, Hämolyse und akute Überempfindlichkeitsreaktionen und periphere Neuropathien. 1 daher sicher und biokompatibel Formulierungen erforderlich sind für die klinische Verwendung von schlechtenly löslichen Krebsmedikamente. Nanocarriers sind vielversprechende Wirkstoffabgabesysteme für die oben genannten Herausforderungen. Diese Nanocarriern umfassen Liposomen, 2 Nanopartikel, 3 Mizellen, 4-7 Polymer-Wirkstoff – Konjugate, 8 und anorganischen Materialien. 9 Mehrere Nanoprodukte (zB Caelyx, Abraxane und Genexol) wurden von den Aufsichtsbehörden genehmigt worden , um Krebspatienten zu behandeln. 10
Polymere Mizellen sind vielversprechende nanoskalige Wirkstoffabgabeträger, die für die Abgabe von Antikrebsmitteln erfolgreich verwendet wurden. 4-7,11,12 Typische polymere Mizellen werden aus amphiphilen Polymeren durch eine Selbstorganisation. Die Kern-Schale-strukturierte polymere Mizellen umfassen eine hydrophile Schale und einen hydrophoben Kern. Die hydrophile Schale kann sterisch Mizellen stabilisieren und ihre Zirkulation im Blutstrom zu verlängern. Der hydrophobe Kern kann wirksam hydrophob d einzukapselnTeppiche. Aufgrund der geringen Größe der Mizellen (typischerweise weniger als 200 nm) und Langzirkulationseigenschaften werden polymere Mizellen angenommen Tumor-Targeting durch erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekte (passive Tumor Targeting) zu erreichen.
Wirkstoffbeladung Stabilität ist für den Tumor kritische Fähigkeit von Mizellen Targeting. Um eine optimale Tumor-Targeting zu erreichen, sollte Mizellen minimale Medikamenten Leckage haben, bevor die Tumorstelle zu erreichen, noch kurz die Droge nach Krebszellen gelangt. Zusätzlich ist Formulierungsstabilität auch eine wesentliche Voraussetzung für die Produktentwicklung, weil Formulierungsstabilität, die Durchführbarkeit der Produktentwicklung bestimmt, sowie die Haltbarkeit der entwickelten Produkte. Kürzlich wurde viel Anstrengung unternommen, die Belastung von Medikamenten in Lieferträger zu verbessern. Die lipophile Prodrug – Ansatz ist eine Strategie , die erforscht wurde Wirkstoffbeladung in Lipid – Nanopartikel und Emulsionen zu verbessern. 13,14 Die Konjugation von Lipiden mit Medikamenten deutlich ihre Lipophilie verbessern und in den lipophilen Komponenten von Nanocarriern Laden und Retention zu verbessern.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladenen Mizellen. Zunächst wird die Syntheseprozedur lipophilen Prodrug für Doxorubicin beschrieben. Dann wird ein Protokoll für die Mizellen mit einem filmDispersionsVerfahren Erzeugen eingeführt. Diese Methode wurde in unseren früheren Studien. 5 DSPE-PEG wurde ausgewählt als Trägermaterial zur Herstellung von Micellen , weil es wurde für Micelle Arzneimittelabgabe erfolgreich eingesetzt erfolgreich eingesetzt. 15,16 Schließlich wir Micelle mehrere in vitro – Assays zur Charakterisierung beschreiben Formulierungen und Anti-Krebs-Aktivität zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit beschreiben wir eine unkomplizierte, schnelle Filmdispersionsverfahren zur Herstellung von Mizellen. Dieses Verfahren nutzt die Selbstorganisation eines amphiphilen Polymers (zB DSPE-PEG) Kern-Schale – strukturierten Mizellen in einer wässrigen Umgebung zu bilden. Diese Mizellen Herstellungsverfahren hat mehrere Vorteile. 1. Es handelt sich eine einfache Formulierungsverfahren, die die Verwendung von komplizierten Zerkleinerungsschritten (wie Extrusion oder Homogenisierung) vermeidet üblicher…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
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