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Medio ambiente

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Published: October 09, 2017
doi:
10.3791/54631
, , , , ,
1Vegetable Crop Research Unit,USDA-ARS, 2Department of Entomology,University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture,University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology,University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics,Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center,Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution,University of Wisconsin-Madison

Summary

Consorzi microbici all’interno alveari dell’ape di bumble arricchiscono e preservare il polline per larve di ape. Mediante sequenziamento di nuova generazione, insieme al laboratorio ed esperimenti sul campo, questo manoscritto descrive protocolli utilizzati per verificare l’ipotesi che residui di fungicidi alterano il microbioma di polline e demographics di Colonia, infine conducendo alla Colonia perdita.

Abstract

I coltivatori spesso utilizzano fungicida spray durante la fioritura per proteggere le colture contro la malattia, che espone le API ai residui di fungicidi. Anche se considerato “bee-safe”, c’è prova di montaggio che residui di fungicida in polline sono associate con i declini di ape (per specie di ape di bumble e miele). Mentre i meccanismi rimangono relativamente sconosciuti, i ricercatori hanno speculato che la simbiosi di ape-microbo sono coinvolti. Microbi giocano un ruolo fondamentale nella conservazione e/o elaborazione di polline, che serve come nutrimento per le API larvale. Alterando la comunità microbica, è probabile che i fungicidi interrompono questi servizi microbo-mediata e quindi compromettono la salute delle API. Questo manoscritto descrive i protocolli utilizzati per indagare i meccanismi indiretti da cui fungicidi possono essere la causa declino di Colonia. Esperimenti di gabbia esponendo le API ai fiori fungicida-trattati hanno già fornito la prima prova che fungicidi causano perdite colonia profonda in un calabrone nativo (Bombus impatiens). Utilizzando il campo rilevanti dosi di fungicidi, una serie di esperimenti sono stati sviluppati per fornire una descrizione più fine delle dinamiche di comunità microbica di polline fungicida-esposti. Cambiamenti nella composizione strutturale di assemblaggi fungine e batteriche all’interno il microbioma di polline sono indagati dal sequenziamento di nuova generazione e analisi metagenomica. Esperimenti sviluppati nel presente documento sono stati progettati per fornire una comprensione meccanicistica di come fungicidi influenzano il microbioma del polline-disposizioni. In definitiva, questi risultati dovrebbero far luce sulla via indiretta attraverso il quale fungicidi possono causare cali di Colonia.

Introduction

Gestito e specie di api selvatiche sono verificati diffuse diminuisce, con importanti implicazioni per entrambi i sistemi naturali e agricoli1. Nonostante sforzi concertati per comprendere le cause di questo problema, i fattori guida declini di ape del miele non sono ancora ben compreso2,3,4. Per alcune specie di api selvatiche, native, la situazione è diventata terribile5,6. Se le popolazioni di API non possono essere sostenute quando si intersecano con l’agricoltura industriale, la popolazione continuerà a cadere e le colture che richiedono impollinatori (35% della produzione mondiale7) resisterà ridotto raccolti.

Mentre molti potenziali fattori quali l’esposizione dell’antiparassitario, malattia e habitat perdita1,4,8,9,10 sono stati implicati nel declino di API del miele, relativamente piccolo è conosciuto circa l’effetto interattivo di questi fattori di stress sulla salute delle API native, all’interno o vicino a sistemi agricoli. Molti sforzi di ricerca corrente continuano a concentrarsi su insetticidi, (ad es., neonicotinoidi11,12), anche se in passato la ricerca indica che fungicidi possono anche svolgere un ruolo nella diminuzione di API alterando la formazione della memoria, ricezione olfattiva13, nido riconoscimento14, l’attività enzimatica e funzioni metaboliche15,16,17. A livello globale, fungicidi continuano ad essere applicati alle colture di fioritura durante la fioritura. Studi recenti hanno documentato che le API comunemente riportare residui fungicida in alveare18, infatti, hanno dimostrato una grande proporzione di alveari testati contenuti fungicida residui19,20. Ulteriore lavoro ha rivelato quel residuo fungicida è associato con alti tassi di miele ape mortalità larvale21,22,23 e la presenza di “polline entombed” all’interno di colonie, che anche se non tossico, è privo di attività microbica e nutrizionalmente compromessa24. Nonostante il fatto che fungicidi lungamente sono stati considerati “bee-safe”, ora c’è prova che l’esposizione al fungicida da solo può causare perdite gravi Colonia in una specie di ape di bumble nativo, Bombus impatiens25.

Per stabilire la causalità tra l’esposizione fungicida e Colonia mortalità, il modus operandi di queste sostanze chimiche devono essere determinate. Come evidenziato nei suoli26, sedimenti27e ambienti acquatici28, mirando ai funghi, fungicidi più probabile alterano fungina abbondanza e diversità all’interno di polline-disposizioni, quindi richiamando un’importante comunità shift che fortemente può favorire i batteri. Senza concorrenti fungine o antagonisti, alcuni batteri patogeni possono proliferare relativamente incontrollato, facilitando il deterioramento di polline-disposizioni. Ricerca passata ha dimostrato che i microrganismi, in particolare lieviti e funghi filamentosi, servire come simbionti nutrizionale per le API29,30,31, proteggere contro parassiti e patogeni32 ,33e fornire la conservazione a lungo termine dei depositi di polline. Fungicidi, pertanto, indirettamente possono danneggiare le API immature interrompendo la comunità microbica che è necessario per fornire tali servizi e/o aumentando la suscettibilità a parassiti e patogeni opportunistici12. Con l’aumento di richieste sulla produzione alimentare, raccolti in tutto il mondo vengono spruzzati ogni anno con fungicidi durante la fioritura, sottolineando la necessità di comprendere la portata di tali effetti indotti da fungicida.

A-data, le lacune di conoscenza primaria relative API native microbica ecologia può essere rappresentato dalle seguenti domande: fino a che punto cambia fungicida della comunità microbica nel ape polline-disposizioni? Quali sono gli effetti a valle di consumare polline con una comunità microbica profondamente alterata? In linea con queste domande ecologicamente germane, gli esperimenti sono stati sviluppati con gli obiettivi primari di rivelare 1) quel residuo fungicida da solo può causare grave Colonia declino in una specie di API native; 2) il grado a cui le comunità microbiche in polline-disposizioni sono alterate di fungicidi e 3) come la salute delle API è influenzata da una comunità microbica gravemente alterata. Gli obiettivi sperimentali sono stati definiti per affrontare le questioni di cui sopra utilizzando una combinazione di esperimenti di laboratorio e campo-base. Utilizzando state-of-the-art metagenomica e tecniche molecolari a fianco dei tradizionali metodi di osservazione del campo, la ricerca si propone di mettere insieme i potenziali effetti dei fungicidi sulla salute delle API.

Il primo obiettivo di questo studio è di dimostrare che l’esposizione fungicida da solo può causare perdite di Colonia significativa tra specie di API native. Uno studio che coinvolge gabbie grande campo è stato utilizzato per studiare gli effetti dell’esposizione di fungicida sulla crescita Colonia di Bombus impatiens, un’ape nativa onnipresente, abbondante negli Stati Uniti (Figura 1, Figura 2, Figura 3). È stato supposto che fungicida-trattati alveari presenterebbe fitness inferiore e Demografia atipico rispetto ai non esposti alveari. I dati ottenuti da questo esperimento supportano questa ipotesi, dimostrando che i residui di fungicidi all’interno di polline possono essere l’unica causa delle perdite di Colonia profonda in un nativo bumble bee specie25. Il secondo obiettivo di questo studio è quello di indagare la risposta del microbioma polline all’esposizione di fungicida. È stato ipotizzato che la composizione della comunità di microbi all’interno di polline-disposizioni esposti ai fungicidi sarà diversa da quello di polline non trattati. Mentre diversità e abbondanza fungina dovrebbero diminuire significativamente, i batteri e/o una singola specie fungina dominante probabilmente crescerà incontrollata in assenza di altri funghi concorrenti. Attraverso una serie di prove in vivo , questi cambiamenti nella composizione della comunità microbica saranno analizzati utilizzando metagenomica.

Protocol

1. esaminare l’effetto del fungicida esposizione su Bumble Bee Colony successo utilizzando campo gabbia esperimenti Set 10 maglia gabbie in un campo piantato con avena. Scavare una trincea intorno ogni gabbia e tutti e quattro i bordi della gabbia della maglia di scavare nel terreno per garantire che le API non possono sfuggire. Magazzino le gabbie con piante fiorite in vaso, che sono noti per essere attraente per le API (ad es. grano saraceno, borragine, alyssum, cosmos e girasoli) (<strong class="xf…

Representative Results

Studio di gabbia di campo: I dati ottenuti dagli esperimenti gabbia colonie dell’ape di bumble presentava una significativa risposta all’esposizione di fungicida. Le arnie fungicida-trattati prodotta significativamente meno lavoratori (12,2 ± 3.8, media ± SE) che gli alveari di controllo (43,2 ± 11,2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (Figura 4). Inoltre, la biomassa delle A…

Discussion

Le indagini sugli effetti dei fungicidi sulla salute delle API sono rimaste un aspetto understudied di strategie di lotta. Il nostro studio si propone di colmare questo divario di conoscenza utilizzando una suite di tecniche complementari che isolano in modo esplicito i potenziali fattori ape declini. La pianificazione, la spiegazione razionale e il rendering di questi esperimenti sono dettagliati sotto.

È importante garantire che nessuna ape sono ammessi per sfuggire la mesh degli esperiment…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autore (i) ringraziare l’Università del Wisconsin Biotechnology Center DNA sequenziamento impianto per la fornitura di amplificazione e sequenziamento servizi, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto e Max Haase per assistenza tecnica con analisi molecolare. Quest’opera è stata sostenuta dai fondi di USDA-Agricultural Research Service appropriato (attuale ricerca Information System #3655-21220-001). Un ulteriore supporto è stato fornito dalla National Science Foundation (sotto Grant No. DEB-1442148), il DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (ufficio DOE di scienza DE BER-FC02-07ER64494) e l’USDA National Institute of Food e agricoltura (progetto portello 1003258). C.T.H. è uno studioso di Pew in scienze biomediche e Alfred Toepfer facoltà Fellow, supportato da Pew Charitable Trusts e la Fondazione Alexander von Humboldt, rispettivamente.

Materials

Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR
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Referencias

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Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).
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