JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medio ambiente

Эмпирическая, метагеномных и вычислительные методы освещают механизмы которых фунгициды компромисса Bee здравоохранения

Published: October 09, 2017
doi:
10.3791/54631
, , , , ,
1Vegetable Crop Research Unit,USDA-ARS, 2Department of Entomology,University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture,University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology,University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics,Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center,Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution,University of Wisconsin-Madison

Summary

Микробные консорциумов в ульях пчел шмелей обогатить и сохранить пыльцы для личинок пчел. С помощью следующего поколения последовательности, а также в лабораторных и полевых экспериментов, этот манускрипт описывает протоколы, используемые для проверки гипотезы, что фунгицида остатков изменить пыльцы микрофлора и население колонии, в конечном счете приводит к колонии потери.

Abstract

Производители часто используют противогрибковые аэрозоли во время цветения для защиты сельскохозяйственных культур против болезней, который предоставляет пчелам фунгицид остатков. Хотя считается «пчела Сейф», есть больше свидетельств того, что остатки фунгицида в пыльце, связанные с пчела спад (для меда и шмелей пчелы видов). Хотя механизмы остаются неизвестными, исследователи предположили, что пчелы Микроб симбиозов участвуют. Микробы играют ключевую роль в сохранении и/или обработка пыльцы, который служит в качестве питания для личинок пчел. Изменяя микробных, вполне вероятно, что фунгициды нарушить эти услуги Микроб опосредованной и тем самым поставить под угрозу здоровье пчел. Эта рукопись описываются протоколы, используемые для расследования косвенные механизма(ов), по которому может быть причиной фунгициды колонии снижение. Кейдж эксперименты, подвергая пчел лечить противогрибковыми цветы уже представили первые свидетельства того, что фунгициды вызывают глубокое колонии потери в родной шмель (Bombus Недотрога). С помощью поля соответствующие дозы фунгицидов, серия экспериментов были разработаны для точного описания динамики микробных фунгицидом облученных пыльцы. Сдвиги в структурный состав грибковых и бактериальных скопления в пыльцы микрофлора расследуются секвенирование нового поколения и метагеномных анализа. Эксперименты, разработаны здесь была призвана обеспечить механистического понимания как фунгициды влияют на микрофлора пыльцы положений. В конечном счете эти выводы должны пролить свет на косвенные путь, через который Фунгициды могут быть причиной снижения колонии.

Introduction

Управляемые и видов диких пчел испытывают широкомасштабное уменьшение, с основными последствиями для обеих природных и сельскохозяйственных систем1. Несмотря на согласованные усилия, чтобы понять причины этой проблемы факторы, способствующие мед пчелы снижение все еще не хорошо понимали2,3,4. Для некоторых видов диких, родной пчел ситуация стала остро5,6. Если пчела населения не может быть устойчивой, когда они пересекаются с промышленного сельского хозяйства, их население будет продолжать падать, и культур, требующих опылителей (35% от мирового производства7) будет терпеть снижается урожай.

В то время как многие потенциальные факторы такие как пестицид выдержка, болезни и Хабитат потери1,4,8,9,10 были вовлечены в мед пчелы снижение, относительно мало известно о интерактивная влияние этих факторов стресса на родной пчел здоровья, в пределах или вблизи сельскохозяйственных систем. Многие текущие исследовательские усилия по-прежнему сосредоточиться на инсектицидов, (например, neonicotinoids11,12), хотя последние исследования показывают, что Фунгициды могут также играть роль в пчела спад на умаление формирования памяти, обонятельные прием13, гнездо признание14, активность ферментов и метаболические функции15,16,17. Глобально фунгициды продолжают применяться до цветения культур во время цветения. Недавние исследования документально, что пчелы обычно приносят фунгицида остатков обратно в улей18, действительно, исследования показали большое количество проверенных ульев содержится фунгицид остатков19,20. Дальнейшей работы показал, что фунгицид остатков ассоциируется с высоким уровнем мед пчелы личиночной смертности21,22,23 и присутствие «квеври пыльцы» в колониях, которые хотя нетоксичные, лишенный микробной активности и является питательной скомпрометированных24. Несмотря на тот факт, что фунгициды давно считается «пчела Сейф», теперь есть доказательства что воздействие только фунгицид может привести к тяжелой колонии потери в родной шмелей пчелы видов, Bombus Импатиенс25.

Для установления причинно-следственной связи между воздействием фунгицидом и колонии смертности, modus operandi этих химических веществ необходимо будет определить. Как подтверждается в почвах26, отложения27и28водной среды, ориентации грибов, фунгициды скорее изменить грибковых изобилия и разнообразия в рамках пыльцы положений, тем самым вызов основных сообщества сдвига может сильно пользу бактерий. Без грибковых конкурентов или антагонисты определенные патогенные бактерии могут размножаться относительно снят, содействие порчи пыльцы положений. Последние исследования продемонстрировал что микроорганизмов, особенно дрожжей и нитевидные грибов, служить питания симбионтами для пчел29,30,31, защиту от паразитов и патогенных32 ,33и обеспечивают долгосрочное сохранение пыльцы магазинов. Фунгициды, таким образом, может косвенно нанести вред незрелых пчел, нарушая микробной сообщества, которая необходима для предоставления таких услуг и/или путем повышения восприимчивости к условно-патогенных возбудителей и паразитов12. С ростом спроса на производство продовольствия, сельскохозяйственных культур во всем мире являются распыляется каждый год с фунгицидами во время цветения, подчеркнув необходимость понять масштабы таких фунгицидом индуцированные эффекты.

К Дата, основной пробелы, связанные с родной пчел микробной экологии могут быть представлены следующие вопросы: в какой степени фунгицид изменения микробной сообщества в рамках пчелиная пыльца положения? Вниз по течению воздействия потребления пыльцы с глубоко измененных микроорганизмов сообществом? В соответствии с этим экологически уместны вопросы, эксперименты были разработаны с основными целями выявления 1) что фунгицид остатков только может вызвать серьезные колонии снижение в родной пчел видов; 2) к которому микробных сообществ в пыльцы положения изменяются, фунгицидов и 3 степень) как пчелы здоровья зависит от сильно изменены микробиологические сообщества. Для решения вышеперечисленных вопросов, используя комбинацию на основе лабораторных и полевых экспериментов были определены экспериментальных целей. С помощью метагеномных искусства и молекулярных методов наряду с традиционными методами поля наблюдения, это исследование стремится собрать воедино потенциальные последствия фунгициды на здоровье пчел.

Первая цель этого исследования должна продемонстрировать, что фунгицид воздействие только может вызвать значительные колонии потери среди видов родной пчел. Исследование с участием большое поле клетки была использована для исследовать влияние фунгицида воздействия на рост колонии Bombus Недотрога, повсеместно, обильные родной пчел в США (рис. 1, рис. 2, рис. 3). Было предположить, что фунгицидом лечение крапивницы представит Нижняя фитнес и атипичные демографии, по сравнению с не подвергаются ульев. Данные, полученные из этого эксперимента поддержали эту гипотезу, демонстрируя, что остатки фунгицида в пыльцы может быть единственной причиной глубоких колонии потери в родной шмелей пчелы видов25. Вторая цель исследования — расследовать ответ микрофлора пыльцы на фунгицид воздействия. Можно предположить, что состав сообщества микробов в пыльцы положения подвергаются фунгициды будет отличается от необработанных пыльцы. Хотя грибковые изобилия и разнообразия, как ожидается, значительно сократится, бактерии или одной доминирующей плесневые будет скорее всего растут снят в отсутствие других конкурирующих грибов. Через серию испытаний в vivo эти сдвиги в состав микробных сообществ будут проанализированы с использованием метагеномики.

Protocol

1. изучить влияние фунгицида воздействия на шмелей пчелы колонии успех с помощью поля Кейдж экспериментов набор до десяти сетка клетки в поле посадили с овсом. Выкопать траншею вокруг каждой клетки и копать всех четырех краев сетки клетке в землю, чтобы обеспечить, что пчелы не мож…

Representative Results

Поле Кейджу учиться: Данные, полученные из клетки эксперименты показали, что значительные ответ на фунгицид воздействия пчел шмелей. Фунгицид лечение крапивницы производится значительно меньше рабочих (12,2 ± 3.8, среднее ± SE) чем ульев упр?…

Discussion

Расследование эффекты фунгициды на здоровье пчел остаются малоисследованный аспект стратегий управления вредителей. Наше исследование стремится преодолеть этот пробел в знаниях, используя набор дополнительных методов, которые явным образом изолировать потенциальных факторов сниж?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Автора(ов) поблагодарить фонд университета Висконсин биотехнологии центр ДНК последовательности для обеспечения усиления и последовательности объектов и услуг, Кейтлин Карлсон, Дженнифер сноровки, Джейк Отто и Max Haase для оказания технической помощи с Молекулярный анализ. Эта работа была поддержана USDA-сельскохозяйственная исследовательская служба ассигнованных средств (текущие исследования информационной системы #3655-21220-001). Дальнейшая поддержка была оказана национальным фондом науки (под № Грант DEB-1442148), Доу Великих озер биоэнергетики исследовательский центр (DOE управление науки де Бер-РС02 07ER64494) и USDA национального института продовольствия и сельского хозяйства (Люк проекта 1003258). C.T.H. — Пью ученый в области биомедицинских наук и сотрудник факультета Альфред Toepfer, поддерживает благотворительные фонды Пью и Фонда Александра фон Гумбольдта, соответственно.

Materials

Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? – A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. “Entombed Pollen”: A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  42. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  43. Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
  44. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  45. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  46. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  47. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  48. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  49. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  50. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  51. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  52. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  53. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  54. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  55. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Tags

Keywords: BumblebeesFungicidesMicrobiomeColony HealthPollinatorField ExperimentMetagenomicsEmpirical Techniques
check_url/es/54631?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image