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Medio ambiente

Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola

Published: October 09, 2017
doi:
10.3791/54631
, , , , ,
1Vegetable Crop Research Unit,USDA-ARS, 2Department of Entomology,University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture,University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology,University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics,Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center,Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution,University of Wisconsin-Madison

Summary

Consorcios microbianos en las colmenas de la abeja bumble enriquecen y conservan el polen para las larvas de abeja. Utilizando la siguiente secuencia de generación, junto con laboratorio y experimentos en el campo, este manuscrito describe protocolos utilizados para probar la hipótesis de que residuos del fungicida alteran el microbioma del polen y datos demográficos de la Colonia, en última instancia conduce a la Colonia pérdida.

Abstract

Los productores a menudo usan aerosoles fungicida durante la floración para proteger los cultivos contra las enfermedades, que expone a las abejas a los residuos de fungicida. Aunque se considera “abeja-safe”, hay creciente evidencia que residuos de fungicida en el polen se asocian con disminución de abeja (para especies de miel y bumble bee). Mientras que los mecanismos siguen siendo relativamente desconocidos, los investigadores han especulado que la simbiosis de abeja-microbio participan. Microbios desempeñan un papel fundamental en la preservación y procesamiento del polen, que sirve de nutrición para larvas abejas. Alterando la comunidad microbiana, es probable que los fungicidas interrumpen estos servicios mediada por el microbio y así comprometen la salud de las abejas. Este manuscrito describe los protocolos para investigar los mecanismos indirectos que fungicidas pueden causar disminución de la Colonia. Experimentos de jaula exponiendo las abejas a las flores tratadas con fungicida ya han proporcionado la primera evidencia que fungicidas causan pérdidas de Colonia profunda en un nativo de abejorro (Bombus impatiens). Utilizando dosis relevantes de campo de fungicidas, han desarrollado una serie de experimentos para proporcionar una descripción más fina de la dinámica de la comunidad microbiana de polen expuesto fungicida. Cambios en la composición estructural de ensamblajes micóticas y bacterianas en el microbioma del polen son investigados por secuenciación de próxima generación y análisis de metagenómica. Experimentos desarrollados en el presente documento han sido diseñados para proporcionar una comprensión mecanicista de cómo fungicidas afectan el microbioma de provisiones de polen. En definitiva, estos resultados deben arrojar luz sobre el camino indirecto a través del cual fungicidas pueden causar disminución de la Colonia.

Introduction

Administrado y especies de abejas silvestres están sufriendo descensos generalizados, con importantes consecuencias para ambos sistemas naturales y agrícolas1. A pesar de los esfuerzos para comprender las causas de este problema, los factores que impulsan la disminución de abejas de miel no son todavía bien entendido2,3,4. Para algunas especies de abejas silvestres, nativas, la situación se ha convertido en grave5,6. Si las poblaciones de abejas no se puede sostener cuando intersectan con la agricultura industrial, su población seguirá cayendo y los cultivos que requieren polinizadores (35% de la producción mundial7) perdurará reduce las cosechas.

Mientras que muchos factores como la exposición a los pesticidas, enfermedad y habitat pérdida1,4,8,9,10 han sido implicados en la disminución de la abeja de miel, relativamente poco se sabe sobre el efecto interactivo de estos estresores sobre la salud de las abejas nativas, dentro o cerca de los sistemas agrícolas. Muchos esfuerzos de investigación actuales seguirán centrándose en insecticidas, (p. ej., neonicotinoides11,12), aunque la última investigación indica que fungicidas también pueden desempeñar un papel en la disminución de la abeja por alterar la formación de la memoria, recepción olfativa13, nido de reconocimiento14, actividad enzimática y las funciones metabólicas15,16,17. A nivel mundial, fungicidas siguen ser aplicadas a los cultivos de flores durante la floración. Estudios recientes han documentado que las abejas traen comúnmente residuos de fungicida a la colmena18, de hecho, estudios han demostrado una gran proporción de colmenas probado contiene fungicida residuos19,20. Otro trabajo ha revelado que residuos de fungicida se asocia con altas tasas de los miel abeja mortalidad larvaria21,22,23 y la presencia de “polen entombed” dentro de las colonias, que aunque no tóxicos, carece de actividad microbiana y es nutricionalmente comprometidos24. A pesar del hecho de que fungicidas han sido considerado como “abeja-safe”, ahora existe evidencia que la exposición a fungicidas solo puede causar pérdidas severas de la Colonia en una especies de abejorro nativo, Bombus impatiens25.

Para establecer causalidad entre exposición de fungicida y la Colonia mortalidad, el modus operandi de estos productos químicos deben determinarse. Como se evidencia en los suelos26,27de sedimentos y ambientes acuáticos28, dirigiéndose a hongos, fungicidas más probables alteran abundancia hongos y diversidad dentro de las disposiciones polen, invocando así una comunidad importante cambio pueden favorecer fuertemente a las bacterias. Sin hongos competidores o antagonistas, ciertas bacterias patógenas pueden proliferar relativamente sin control, facilitando la descomposición del polen-disposiciones. Más allá de la investigación ha demostrado que microorganismos, especialmente levaduras y hongos filamentosos, sirven como simbiontes nutritivos para las abejas29,30,31, protege contra parásitos y patógenos32 ,33y preservación a largo plazo de los almacenes de polen. Fungicidas, por lo tanto, indirectamente perjudiquen las abejas inmaduras interrumpiendo la comunidad microbiana necesaria para prestar estos servicios o incrementando la susceptibilidad a patógenos y parásitos oportunistas12. Con el aumento de las demandas en producción de alimentos, cultivos en todo el mundo están siendo rociados cada año con fungicidas durante la floración, lo que subraya la necesidad de comprender la magnitud de tales efectos inducidos por el fungicida.

Hasta la fecha, las lagunas de conocimiento primaria relativos a la abeja nativa microbiana ecología puede ser representada por las siguientes preguntas: ¿en qué medida cambia fungicida la comunidad microbiana dentro de polen de abeja-disposiciones? ¿Cuáles son los impactos aguas abajo de consumir polen una comunidad microbiana profundamente alterada? De conformidad con estas preguntas ecológicamente pertinentes, experimentos fueron desarrollados con los objetivos primarios de revelar 1) que residuos de fungicida solo pueden causar disminución severa de la Colonia en una especie de abeja nativa; 2) el grado en que las comunidades microbianas en las provisiones de polen son alteradas por fungicidas y 3) cómo una comunidad microbiana severamente alterada afecta salud de las abejas. Se definieron los objetivos experimentales para hacer frente a las preguntas anteriores utilizando una combinación de experimentos basados en laboratorio y campo. Mediante metagenómica de vanguardia y técnicas moleculares junto a métodos tradicionales de observación del campo, esta investigación tiene como objetivo juntar los posibles efectos de fungicidas en la salud de las abejas.

El primer objetivo de este estudio es demostrar que fungicida exposición solo puede causar pérdidas significativas de la Colonia entre especies nativas. Un estudio con jaulas de campo grande fue utilizado para investigar los efectos de la exposición de fungicidas sobre el crecimiento de colonias de Bombus impatiens, una abeja nativa ubicua, abundante en los Estados Unidos (figura 1, figura 2, figura 3). Fue presumido que colmenas tratadas con fungicida presentaría menor aptitud y Demografía atípica comparado con colmenas no expuestos. Datos obtenidos de este experimento apoyaron esta hipótesis, demostrando que residuos de fungicida dentro de polen pueden ser la única causa de las pérdidas de Colonia profunda en un nativo bumble bee especie25. El segundo objetivo de este estudio es investigar la respuesta del microbioma del polen a la exposición de fungicida. Se presume que la composición de la comunidad de microbios dentro de polen-las disposiciones expuestas a fungicidas será diferente de la de polen sin tratar. Mientras que la diversidad y abundancia de hongos se espera que disminuyan significativamente, bacterias o una sola especie fúngica dominante probablemente crecerá sin control en ausencia de otros hongos competidores. A través de una serie de ensayos in vivo , estos cambios en la composición de la comunidad microbiana se analizará mediante metagenómica.

Protocol

1. examinar el efecto de la exposición al fungicida en Bumble Bee Colonia éxito usando jaula de experimentos de campo conjunto de hasta diez jaulas de malla en un campo sembrado con avena. Cavar una zanja alrededor de cada jaula y cavar los cuatro bordes de la jaula de malla en el suelo para asegurarse de que no pueden escapar de las abejas. Stock las jaulas con macetas, plantas con flores que son atractivas para las abejas (por ejemplo, trigo, borraja, alyssum, cosmos y girasoles) (<strong class="x…

Representative Results

Estudio de la jaula del campo: Datos obtenidos de los experimentos de jaula demostraron que las colonias de abeja bumble tuvieron una respuesta significativa a la exposición de fungicida. Las colmenas tratadas con fungicida produjeron significativamente menos trabajadores (12,2 ± 3.8, media ± SE) que las colmenas de control (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figura 4</…

Discussion

Las investigaciones sobre los efectos de fungicidas en la salud de las abejas se han mantenido un estudiado aspecto de estrategias de manejo de plagas. Nuestro estudio pretende brecha este conocimiento mediante el uso de un conjunto de técnicas complementarias que explícitamente aislar los factores potenciales que impulsan abeja disminuye. La planificación, razonamiento y representación de estos experimentos se detallan a continuación.

Es importante asegurarse de que no las abejas se les …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El autor (es) gracias a la Universidad de Wisconsin biotecnología centro DNA secuencia instalación para proporcionar amplificación secuenciación instalaciones y servicios, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto y Max Haase para asistencia técnica con Análisis molecular. Este trabajo fue apoyado por fondos de USDA-Agricultural Research Service apropiado (actual investigación sistema de información #3655-21220-001). Apoyo adicional fue proporcionado por la National Science Foundation (bajo la subvención no. DEB-1442148), el DOE grandes lagos Bioenergy Research Center (DOE oficina de ciencia DE BER-FC02-07ER64494) y el Instituto Nacional de alimentos de USDA y la agricultura (proyecto 1003258 de la portilla). C.T.H. es un erudito de Pew en las ciencias biomédicas y Alfred Toepfer facultad miembro, apoyada por la Pew Charitable Trusts y la Fundación Alexander von Humboldt, respectivamente.

Materials

Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR
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Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).
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