Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit
Summary
Mikrobielle Konsortien innerhalb von Bumble Bee Hives bereichern und Pollen für Bienenlarven bewahren. Sequenzierung der nächsten Generation, zusammen mit Labor und Feld-basierte Experimente mit beschreibt diesem Manuskript Protokolle verwendet, um die Hypothese zu testen, dass Fungizid Rückstände der Pollen Mikrobiom und Kolonie Demographie, letztlich zu Kolonie verändern Verlust.
Abstract
Züchter verwenden oft Fungizid Sprays während der Blüte Pflanzen gegen Krankheit, schützen die Bienen Fungizid Rückstände anführt. Obwohl als “Biene-Safe”, gibt es Anzeichen dafür, dass Fungizid Rückstände Pollen Biene Rückgänge (für Honig und Bumble Bee Arten) zugeordnet sind. Während die Mechanismen relativ unbekannt bleiben, haben Forscher spekulierten, daß Biene-Mikrobe Symbiosen beteiligt sind. Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung und/oder Verarbeitung von Pollen, die als Nahrung für die Larven Bienen dient. Durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft, ist es wahrscheinlich, dass Fungizide diese Mikrobe-vermittelten Leistungen stören und damit Gesundheit der Bienen gefährden. Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle verwendet, um die indirekte Mechanismen zu untersuchen, durch die Fungizide Kolonie Rückgang verursachen können. Käfig Experimenten auszusetzen Bienen, Blumen Fungizid behandelt haben bereits die ersten belegt, dass Fungizide Tiefe Völkerverluste in eine native Hummel (Bombus Impatiens) verursachen. Mit Feld-relevanten Dosen von Fungiziden, eine Reihe von Experimenten wurden entwickelt, um eine feinere Beschreibung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik der Fungizid-exponierten Pollen zu bieten. Verschiebungen in der strukturellen Zusammensetzung der Pilz- und bakterielle Assemblagen innerhalb der Pollen Microbiome sind von Next Generation Sequencing und metagenomischen Analyse untersucht. Experimente, die hierin entwickelt wurden so bieten ein mechanistisches Verständnis wie Fungizide Microbiome Pollen-Bestimmungen auswirken. Letztendlich sollten diese Erkenntnisse auf dem indirekten Weg Licht durch die Fungizide Kolonie Rückgänge verursachen können.
Introduction
Verwaltet und Wildbienenarten sind weit verbreitete Rückgänge, mit großen Auswirkungen auf die beiden natürlichen und landwirtschaftlichen Systemen1erleben. Trotz konzertierte Anstrengungen, die Ursachen des Problems zu verstehen sind die Faktoren, die Honig Biene Rückgänge noch nicht gut verstanden,2,3,4. Für bestimmte Arten von wild, native Bienen ist die Situation dringend5,6geworden. Wenn Bienenvölker nicht aufrechterhalten werden können, wenn sie mit der industriellen Landwirtschaft schneiden, ihre Bevölkerungen werden weiter sinken und die Pflanzen erfordert Bestäuber (35 % der Weltproduktion7) ertragen werden verringert ernten.
Während viele mögliche Faktoren wie Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung Krankheit und Lebensraum Verlust1,4,8,9,10 in Honig Biene Rückgang verwickelt, über die interaktive Wirkung von diesen Stressoren auf heimischen Bienen Gesundheit, innerhalb oder in der Nähe von landwirtschaftlichen Systemen ist relativ wenig bekannt. Viele aktuelle Forschungsbemühungen weiterhin Insektizide (z.B., Neonicotinoide11,12), obwohl die letzten Forschung zeigt, dass Fungizide auch ein Rückgang der Biene Rolle können durch Beeinträchtigung der Gedächtnisbildung konzentrieren, olfaktorische Rezeption13, Nest Anerkennung14, Enzymaktivität und Stoffwechselfunktionen15,16,17. Fungizide weiterhin weltweit, während der Blüte zu blühenden Pflanzen angewendet werden. Neuere Studien belegen, dass Bienen bringen häufig Fungizid Rückstände zurück in den Bienenstock18, in der Tat, einen Großteil der getesteten Nesselsucht enthaltenen Fungizid Rückstände19,20Studien. Weiterarbeit hat ergeben, dass Fungizid Rückstände ist verbunden mit hohen Honig Biene Larven Mortalität21,22,23 und das Vorhandensein von “begraben Pollen” innerhalb der Kolonien, die zwar ungiftig, ist frei von mikrobielle Aktivität und ernährungsphysiologisch kompromittierten24. Trotz der Tatsache, dass Fungizide lange “Biene-Safe” gegolten haben, gibt es jetzt beweisen, dass die Exposition zu Fungizid allein in einer nativen Bumble Bee Spezies, Bombus Impatiens25schwere Kolonie Verluste verursachen kann.
Um Kausalität zwischen Fungizid-Exposition und Kolonie zu etablieren Sterblichkeit, die Arbeitsweise dieser Chemikalien müssen bestimmt werden. Wie in den Böden26, Sedimente27und aquatischen Umwelt28, belegt durch die Ausrichtung auf Pilze, Fungizide am ehesten verändern Pilz Fülle und Vielfalt im Rahmen der Pollen-Vorgaben damit Aufrufen einer großen Gemeinschaft zu verlagern, die Bakterien können stark begünstigen. Ohne Pilz Konkurrenten oder Antagonisten können bestimmte pathogenen Bakterien relativ ungeprüft, erleichtern das Verderben von Pollen-Bestimmungen vermehren. Frühere Forschung hat gezeigt, dass Mikroorganismen, insbesondere Hefen und filamentöse Pilze dienen als Nahrungsergänzung Symbionten für Bienen29,30,31, Schutz gegen Parasiten und Krankheitserreger32 ,33, und Langzeitarchivierung von Pollen Läden bieten. Fungizide, können deshalb, unreife Bienen indirekt Schaden, durch Unterbrechung der mikrobiellen Gemeinschaft, die benötigt wird, um diese Leistungen zu erbringen und/oder durch eine Erhöhung der Anfälligkeit für opportunistische Krankheitserreger und Parasiten12. Mit zunehmender Anforderungen an die Herstellung von Lebensmitteln, sind Kulturen weltweit jedes Jahr mit Fungiziden während der Blüte, unterstreicht die Notwendigkeit zu verstehen, das Ausmaß der Fungizid-induzierte Effekte besprüht.
Bis dato, die primäre Wissenslücken in Bezug auf einheimische Biene mikrobielle Ökologie kann durch die folgenden Fragen dargestellt werden: , inwieweit ändert Fungizid die mikrobielle Gemeinschaft im Rahmen der Biene Blütenstaub-Vorgaben? Was sind die nachgelagerten Auswirkungen des Verzehrs von Pollen mit einer grundlegend veränderten mikrobiellen Gemeinschaft? Im Einklang mit dieser ökologisch germane Fragen, wurden Experimente mit den primären Zielen der Enthüllung 1 entwickelt), Fungizid Rückstände allein kann schwere Kolonie Rückgang verursachen, in einem heimischen Bienenarten; (2) der Grad, mikrobielle Gemeinschaften in Pollen-Bestimmungen sind durch Fungizide und 3 verändert) wie Bienengesundheit von einer stark veränderten mikrobiellen Gemeinschaft betroffen ist. Die experimentelle Ziele wurden definiert, um die oben genannten Fragen mit einer Kombination aus Labor und Feld-basierten Experimente. Mit State-of-the-Art metagenomische und Molekulare Techniken neben traditionellen Methoden der Bereich Beobachtung, diese Forschung zielt darauf ab, die möglichen Auswirkungen von Fungiziden auf die Bienengesundheit zusammenzusetzen.
Das erste Ziel der vorliegenden Studie soll zeigen, dass Fungizid Exposition allein dazu führen, erhebliche Völkerverluste unter einheimischen Bienenarten dass kann. Eine Studie mit Grossfeld Käfige wurde verwendet, um die Auswirkungen einer Fungizid auf das Koloniewachstum von Bombus Impatiens, eine allgegenwärtige, reichlich einheimische Biene in den USA (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3) untersuchen. Es wurde vermutet, dass Fungizid behandelt Nesselsucht geringer Fitness und atypische Demografie im Vergleich zu nicht-exponierten Nesselsucht präsentieren würde. Dieses Experiment gewonnene Daten unterstützt diese Hypothese, zeigen, dass Fungizid Rückstände im Pollen die alleinige Ursache für tiefe Völkerverluste in einer nativen Bumble Bee Arten25sein können. Das zweite Ziel dieser Studie ist, die Reaktion der Pollen Microbiome Fungizid Exposition zu untersuchen. Es wird vermutet, dass die Gemeinschaft Zusammensetzung der Mikroben im Rahmen der Pollen-Vorgaben ausgesetzt, Fungizide anders als die der unbehandelten Pollen werden. Während Pilz Fülle und Vielfalt deutlich zurückgehen voraussichtlich werden, werden Bakterien und/oder einer einzigen dominanten Pilzarten wahrscheinlich unkontrolliert in der Abwesenheit von anderen konkurrierenden Pilze wachsen. Durch eine Reihe von in-Vivo -Studien werden diese Verschiebungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft mit Metagenomik analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Untersuchungen über die Auswirkungen der Fungizide auf die Bienengesundheit blieben ein erforschten Aspekt des Schädlings-Management-Strategien. Unsere Studie zielt darauf ab, diese Wissenslücke zu überbrücken, mithilfe einer Reihe von ergänzenden Techniken, die explizit die potenziellen Faktoren Biene Rückgänge zu isolieren. Planung, Begründung und Darstellung dieser Experimente sind nachfolgend aufgeführt.
Es ist darauf zu achten, dass keine Bienen erlaubt sind, um das Netz der Kä…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der University of Wisconsin Biotechnologie Center DNA Sequenzierung Anlage für Bereitstellung Amplifikation und Sequenzierung Einrichtungen und Dienstleistungen, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto und Max Haase für die Bereitstellung technischen Hilfe molekulare Analyse. Diese Arbeit wurde von USDA-Agricultural Research Service angeeignet Mittel (aktuelle Research Information System #3655-21220-001) unterstützt. Weiterer Unterstützung wurde von der National Science Foundation (unter Grant Nr. bereitgestellt. Deb-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494), und der USDA National Institute of Food und Landwirtschaft (Luke Projekt 1003258). C.T.H. ist ein Pew Gelehrter in den biomedizinischen Wissenschaften und ein Alfred Toepfer Faculty Fellow, bzw. von der Pew Charitable Trusts und der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.
Materials
| Natupol Beehive | Koppert | USRESM1 | 16 hives |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Abound | Syngenta | 4033540 | Azoxystrobin 22.9% |
| Chlorothalonil | Syngenta | 3452 | Fungicide used for trials |
| Pollen granules | Bee rescued | B004D5650C | 3X 16oz bottles, pollen for trials |
| Bacterial strains for inoculation | Currie Lab | ||
| Yeast strains for inoculation | Hittinger lab | ||
| Primer pairs | UW Biotech Center | ||
| DNA Isolation Kit | Mo Bio | 12830-50 | Commercial DNA isolation kit |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification tool |
| Select Master Mix for CFX | Thermo Fisher | 4472952 | Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye. |
| Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855196 | Instrument used for PCR amplification |
| PCR Clean-Up Kit, | Axygen | 10159-696 | Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes |
| DNA 1000 Kit | Agilent | 5067-1504 | Used for sizing and analysis of DNA fragments |
| MiSeq Sequencer | Illumina | Used for next-generation sequencing | |
| Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) | VWR |
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