JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

Een In Vitro Model voor het bestuderen van cellulaire transformatie door Kaposi sarcoom Herpesvirus

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Kaposi sarcoom (KS) is een tumor die is veroorzaakt door infectie met de oncogene virus Humaan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). De endothelial cell cultuur model hier beschreven is uniek geschikt voor de studie van de mechanismen waarmee KSHV gastheer cellen transformeert.

Abstract

Kaposi sarcoom (KS) is een ongewone tumor bestaat uit delende cellen van de spindel dat is geïnitieerd door infectie van endotheliale cellen (EG) met KSHV, en meestal ontwikkelt in de instelling bij immuunsuppressie. Ondanks decennia van onderzoek, optimale behandeling van KS blijft slecht gedefinieerde en klinische resultaten zijn vooral ongunstige in resource-beperkte instellingen. KS laesies worden gedreven door pathologische angiogenese, chronische ontsteking en oncogenese en verschillende in vitro cel cultuur modellen zijn ontwikkeld om deze processen te bestuderen. KS vloeit voort uit KSHV-geïnfecteerde cellen van de oorsprong van het endotheel, dus EG-afstamming-cellen zorgen voor de meest geschikte in vitro surrogaten van de voorloper van de spindel cel. Echter, omdat EG hebben een levensduur beperkt in vitro , en zoals de oncogene mechanismen werkzaam bij KSHV zijn minder efficiënt zijn dan die van andere tumorigene virussen, is moeilijk te beoordelen van de processen van transformatie in primaire of telomerase-vereeuwigd EC. Daarom werd een nieuwe EG gebaseerde cultuur model ontwikkeld dat ondersteunt transformatie na infectie met KSHV. Ectopische uitdrukking van de genen van de E6 en E7 van humaan papillomavirus type 16 zorgt voor uitgebreide cultuur van leeftijd – en passage-matched mock – en KSHV-besmette EG en ondersteunt de ontwikkeling van een echt getransformeerd (dat wil zeggen, tumorigene) fenotype in geïnfecteerde celculturen . Dit hanteerbare en zeer reproduceerbaar model van KS heeft de ontdekking van verschillende essentiële signaalroutes met een hoog potentieel voor vertaling in klinische instellingen vergemakkelijkt.

Introduction

Kaposi sarcoom (KS) is een multi focale angioproliferative tumor beïnvloeden dermale, cutane en viscerale sites die meestal in het kader van geavanceerde immuun onderdrukking1 ontwikkelt. Vier epidemiologische vormen zijn beschreven: classic, een vadsig formulier buikvliesontsteking meestal oudere mensen van mediterrane en Midden-Oosten erfgoed; iatrogene, als gevolg van behandeling met Immunosuppressieve medicijnen na orgaantransplantatie; epidemie, een AIDS-definiëren kanker; en endemisch, een HIV-zelfstandige vorm vaak voor bij kinderen in endemische gebieden in Afrika. Met de komst van effectieve combinatie regimes van de anti-retrovirale geneesmiddelen voor de behandeling van HIV, is epidemische KS veel minder vaak gediagnosticeerd in ontwikkelingslanden. De klinisch agressieve endemische en epidemische vormen blijven echter onder het meest gediagnosticeerde kankers in vele Afrikaanse landen2,–3,4. Daarom is de identificatie van effectieve pathogenese-gerichte medicijnen voor behandeling van KS een onderzoeksprioriteit.

Histologisch, worden KS laesies gekenmerkt door uitgebreide maar abnormale neovascularization waarbij spindel cellen van EG oorsprong discontinue vasculaire netwerken5vormen. Deze abnormale schepen (“vasculaire spleten”) toestaan extravasation van erytrocyten, waardoor laesies hun karakteristieke kleur. Daarnaast bevatten laesies talrijke leukocyten, die kenmerkend zijn voor chronische ontsteking (dat wil zeggen, lymfocyten, macrofagen en plasmacellen). Regressie van KS letsels na immuunsysteem reconstitutie werd genoemd, wat suggereert dat KS kenmerken van zowel een hyper-proliferatieve laesie en een ware tumor6,7,8,9 heeft.

KS herpesvirus (KSHV), de verwekker van KS, werd in 199410geïdentificeerd. Sinds dan veel in vitro cultuur van de cel modellen zijn ontwikkeld zodat de pathogenese studies, met inbegrip van cellen transplanteren van tumor biopsie materiaal en primaire of uiting van telomerase EG geïnfecteerd met KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. geen van de momenteel beschikbare modellen volledig recapituleert de KS tumor communicatie, maar alle waardevolle kennis aan ons begrip van de pathobiology van KSHV infectie hebben bijgedragen. In tegenstelling tot de andere bekende tumorigene Humaan herpesvirus Epstein – Barr virus (EBV), wordt het KSHV niet gemakkelijk transformeren bij cellen in cultuur na DOVO infectie19,20,21, 22. echter deze beperking heeft overwonnen door transducing primaire menselijke EG van hetzij microvasculaire of lymfatische oorsprong gemengd met de E6 en E7 genen van humaan papillomavirus typen 16 voorafgaand aan infectie met KSHV23,24 . Uitdrukking van deze exogene oncogenen verhoogt drastisch het transformerende potentieel van KSHV in vitro gedeeltelijk door de toekenning van aanvullende remming van de Retinoblastoom eiwitten en p5323,24. Deze EG transductie methode heeft toegestaan meerdere laboratoria vast te stellen van belangrijke wijzigingen in ontvangende cel de expressie van genen die worden veroorzaakt door infectie van de KSHV en die lijken te vergemakkelijken van KS cel overleving en proliferatie25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de hierin beschreven protocollen zijn eenvoudig en zeer reproduceerbaar, en zal resulteren in het genereren van leeftijd – en passage-matched KSHV-geïnfecteerde EG en mock-geïnfecteerde besturingselementen die kunnen worden gekweekt voor veel langer dan primaire cellen en zal zorgen voor het onderzoek van oncogene mechanismen werkzaam bij KSHV. Hoewel het protocol bevat een methode voor de productie van wild type KSHV uit de primaire effusie lymfoom cellijn BCBL-1, E6/E7-vereeuwigd EG zijn ook zeer gevoelig voor infectie met recombinant BACmid afgeleid KSHV-BAC1630. Protocollen voor bereiding van BAC16 worden elders beschreven33,34.

Protocol

Opmerking: alle procedures die worden beschreven in dit protocol moeten worden uitgevoerd onder BSL-2 voorwaarden. 1. KSHV voorraad voorbereiding bereiden TNE buffer: Los 292.24 mg EDTA in ddH 2 O, 225 mL brengen en aan te passen aan pH 8. Los 605.7 mg Tris in ddH 2 O, breng aan 225 mL, en aan te passen aan pH 8. EDTA en Tris oplossingen combineren, Voeg 4.38 g NaCl, aanpassen eindvolume tot 500 mL, filteren steriliseren en bewaren bij 4 ° C ….

Representative Results

De morfologie van primaire EG klassiek wordt beschreven als “kasseistrook stone”, en deze morfologie is niet gewijzigd door de uitdrukking van het papillomavirus E6 en E7 genen (figuur 1A). Expressie van de E6 en E7 genen alleen er niet toe brengt een getransformeerde fenotype; Dus, cellen zijn gevoelig voor remming contact en zal ophouden verdelen bij het bereiken van de samenvloeiing in cultuur. De cellen zal echter vermenigvuldigen en regrow tot samenkomst op trypsineb…

Discussion

Oncogenese is een meerstaps proces dat belangrijke waarborgen binnen een organisme36omzeilt. Zoals KS laesies bestaan langs een spectrum van chronische ontsteking aan ware sarcomen, vereist opheldering van bepaalde pathofysiologische processen gemedieerd door KSHV dat sommige studies worden uitgevoerd in cel cultuur modellen die ondersteuning bieden voor transformatie9. Opgemerkt moet worden dat verlies van contact inhibitie en anchorage-afhankelijke groei, fenotypes indica…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de HD068322 van de K12 (SCM); R01 CA179921 en P51 OD011092 (AVM); en 14PRE20320014 van de Amerika hart Association (SB).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image