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Biología

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Abstract

Kaposi-Sarkom (KS) ist eine ungewöhnliche Tumor bestehend aus wuchernden Spindel Zellen, die durch Infektion der Endothelzellen (EG) mit KSHV initiiert und entwickelt sich in den meisten Fällen im Rahmen der Immunsuppression. Trotz jahrzehntelanger Forschung optimale Behandlung von KS bleibt schlecht definiert und klinischen Ergebnisse sind besonders ungünstig in beschränkten Ressourcen. KS-Läsionen sind getrieben von pathologischen Angiogenese, chronische Entzündungen und Onkogenese und verschiedene in-vitro- Kultur Zellmodelle wurden entwickelt, um diese Prozesse zu studieren. KS ergibt sich aus KSHV-infizierten Zellen endothelialen Ursprungs, also EC-Linie Zellen am besten geeignete in-vitro- Surrogate von der Spindel Zelle Vorläufer zur Verfügung stellen. Da EG haben eine begrenzte in-vitro- Lebensdauer, und die onkogenen Mechanismen KSHV angestellt sind weniger effizient als die der anderen tumorigenic Viren, es war jedoch schwierig zu beurteilen, die Prozesse der Transformation in der PV oder Telomerase-verewigt EC Daher wurde ein neuartiger EG basierende Kultur-Modell entwickelt, die Transformation nach Infektion mit KSHV bereitwillig unterstützt. Ektopische Expression der Gene des menschlichen Papillomavirus Typ 16 E6 und E7 erweiterte Kultur von Alter und Durchgang abgestimmt Mock und KSHV-infizierten EG ermöglicht und unterstützt die Entwicklung einer wahrhaft transformierten (d. h. tumorigenic) Phänotyp in infizierten Zellkulturen . Diese gefügig und hoch reproduzierbare Modell KS hat die Entdeckung von mehreren wesentlichen Signalwege mit hohem Potenzial für die Übersetzung in klinischen Umgebungen erleichtert.

Introduction

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Multi-focal Angioproliferative Tumor Auswirkungen auf Haut, Schleimhaut und viszeralen Websites, der am häufigsten in der Umgebung von fortgeschrittenen Immununterdrückung1entwickelt. Vier epidemiologische Formen sind beschrieben worden: Classic, eine träge Form, das in der Regel ältere Menschen des Mittelmeerraums und des Nahen Ostens Erbes; iatrogene, durch Behandlung mit immunsuppressiven Medikamenten nach Organtransplantationen; Epidemie, eine AIDS-definierenden Krebs; und eine HIV-unabhängige Form häufig bei Kindern in endemischen Gebieten in Afrika endemisch. Mit dem Aufkommen der effektive Kombination Anti-retroviral Drogen-Therapien für die Behandlung von HIV ist Epidemie KS in Entwicklungsländern viel seltener diagnostiziert. Jedoch bleiben die klinisch aggressiven endemischen und epidemischen Formen unter die am häufigsten diagnostizierten Krebsarten in vielen afrikanischen Ländern2,3,4. Daher ist die Identifizierung von wirksame Pathogenese gezielt Medikamente zur Behandlung von KS Forschungsschwerpunkt.

Histologisch, zeichnen sich KS-Läsionen durch umfangreiche aber abnorme Neovaskularisation wobei Spindel Zellen EG Ursprungs diskontinuierliche vaskulären Netzwerken5bilden. Diese abnormen Gefäße (“vaskuläre Schlitze”) erlauben Extravasation der Erythrozyten, die Läsionen ihre charakteristische Farbe geben. Darüber hinaus enthalten Läsionen zahlreiche Leukozyten, die chronischen Entzündung (z.B. Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen) charakterisieren. Rückbildung der KS-Läsionen nach Immunrekonstitution wurde beschrieben, was darauf hindeutet, dass KS Funktionen einer hyper-proliferative Läsion und wahre Tumor6,7,8,9.

KS Herpesvirus (KSHV), dem Erreger der KS, wurde im Jahr 199410identifiziert. Seit dann viele in Vitro Zellkultur Modelle entwickelt worden um Pathogenese Studien ermöglichen, einschließlich der Zellen aus Biopsie Tumormaterial und primäre explantiert oder Telomerase exprimierenden EG infiziert mit KSHV in-vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. keines der derzeit verfügbaren Modelle voll rekapituliert die KS Tumor Mikroumgebung, aber alle haben wertvolles Wissen zu unserem Verständnis der Pathobiologie KSHV Infektion beigetragen. Im Gegensatz zu den anderen bekannten tumorigenic menschliche Herpesvirus Epstein – Barr-Virus (EBV), KSHV nicht leicht transformiert Zellen in Kultur nach de Novo Infektion19,20,21, 22. aber diese Einschränkung überwunden durch transducing primären menschlichen EG entweder gemischt mikrovaskuläre oder lymphatischen Ursprungs mit der E6 und E7 Gene aus humanem Papillomavirus Typ 16 vor der Infektion mit KSHV23,24 . Ausdruck dieser exogene Onkogene erhöht drastisch das transformierende Potenzial der KSHV in-vitro- teilweise durch weitere Hemmung der Retinoblastoma Protein und p5323,24. Diese EG-Transduktion Methode hat mehrere Labore, wichtige Veränderungen im Host zu identifizieren erlaubt Zelle Genexpression, die durch KSHV Infektion hervorgerufen und, die Erleichterung der KS Zelle überleben und Verbreitung25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. der hierin beschriebenen Protokolle sind unkompliziert und hoch reproduzierbare und führt zu der Generation von Alter und Durchgang abgestimmt KSHV-infizierten EG und Mock-infizierten Steuerelemente, können viel länger als primäre Zellen gezüchtet werden und werden, ermöglichen Sie die Untersuchung von onkogenen Mechanismen KSHV angestellt. Obwohl das Protokoll enthält ein Verfahren zur Herstellung von Wildtyp KSHV aus der primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1, E6/E7-verewigt EG sind auch sehr anfällig für Infektionen mit rekombinanten BACmid abgeleitet KSHV-BAC1630. Protokolle für die Vorbereitung des BAC16 sind an anderer Stelle beschrieben33,34.

Protocol

Hinweis: alle in diesem Protokoll beschriebene Verfahren durchgeführt werden, unter Bedingungen der BSL-2. 1. KSHV Lager Vorbereitung bereiten TNE Puffer: auflösen 292,24 mg EDTA in DdH 2 O, 225 mL bringen, und passen Sie auf pH 8. 605,7 mg Tris in DdH 2 O auflösen, bis 225 mL bringen und auf pH 8 anpassen. EDTA und Tris Lösungen kombinieren, hinzufügen 4,38 g NaCl, endgültige Lautstärke bis 500 mL, filtern, Sterilisation und Lagerung bei 4 ° C .<…

Representative Results

Die Morphologie der primären EG wird klassisch als “Kopfsteinpflaster” beschrieben, und diese Morphologie wird nicht durch Ausdruck der Papillomavirus E6 und E7 Gene (Abbildung 1A) verändert. Ausdruck der E6 und E7 Gene allein nicht dazu veranlassen, einen veränderten Phänotyp; so Zellen sind anfällig für Hemmung wenden Sie sich an und werden nicht mehr geteilt beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. Die Zellen werden jedoch vermehren und nachwachsen, Zusammenflu…

Discussion

Onkogenese ist ein mehrstufiger Prozess, der wichtige Sicherheitsvorkehrungen innerhalb eines Organismus36umgeht. KS-Läsionen entlang ein Spektrum der chronischen Entzündung zu wahren Sarkome bestehen, erfordert Aufklärung bestimmter pathophysiologischen Prozesse durch KSHV vermittelt, dass einige Studien in Zellmodellen Kultur durchgeführt werden, die Umwandlung9unterstützen. Es sollte angemerkt werden, dass Verlust von Kontakt-Hemmung und Anchorage-abhängigen Wachst…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch K12 HD068322 (SCM) unterstützt; R01 CA179921 und P51 OD011092 (AVM); und 14PRE20320014 aus Amerika Heart Association (SB).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
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Referencias

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

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McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
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